多能干细胞（PSCs）可分化为所有三个胚层的衍生物；然而，对嵌合胚胎的稳健贡献主要局限于早期多能状态。小鼠胚胎干细胞（mESCs）能高效贡献于嵌合体，而着床后小鼠上胚层来源干细胞（mEpiSCs）则缺乏这种发育能力。mESC和mEpiSC的自我更新依赖于大部分相反的信号通路，这使得它们成为揭示共享调控原理的严格系统。2026年4月9日发表于 Cell Research 的一项研究中，南加州大学与密歇根大学的联合团队（Wang D., Wang X.K.等）通过小分子筛选，鉴定出选择性GSK3α抑制剂BRD0705能够分别与PD0325901（维持mESCs）或IWR1（维持mEpiSCs）协同，长期维持这两种多能干细胞的自我更新。值得注意的是，BRD0705 + IWR1（BI）条件首次实现了mESCs和mEpiSCs在同一培养体系中的长期共存（超过一个月），且两者均保持各自独特的转录组和表观遗传身份。机制上，BRD0705通过β-catenin非依赖的方式选择性抑制GSK3α，通过激活PI3K/AKT/mTOR轴来促进自我更新。此外，BI条件还支持了小鼠形成态干细胞和神经干细胞的维持。该研究将GSK3α定义为跨越多种干细胞状态的“干性检查点”，其选择性抑制有助于在不同信号环境中稳定干细胞身份。

研究亮点速览

1. 小分子筛选：鉴定出选择性GSK3α抑制剂BRD0705，能联合PD0325901长期维持mESC自我更新，或联合IWR1长期维持mEpiSC自我更新。
2. 同一培养体系中的共存：BRD0705 + IWR1（BI）首次实现了mESCs和mEpiSCs在长达一个月以上的共培养中稳定共存，且两种细胞保持各自独特的发育身份（mESC具有嵌合体贡献能力，mEpiSC则无）。
3. 机制新颖：与广谱GSK3抑制剂CHIR99021不同，BRD0705通过β-catenin非依赖的方式促进自我更新，不激活经典WNT信号，而是通过PI3K/AKT/mTOR轴发挥作用。
4. 靶点验证：利用基因敲除（Gsk3α–/– vs. Gsk3β–/–）和化学遗传学（3MB-PP1）系统，证实GSK3α是关键的药物靶点，GSK3β抑制反而导致mEpiSC分化。
5. 跨细胞类型适用：BI条件同样支持小鼠形成态干细胞（formative stem cells）和SOX1+神经干细胞的维持，表明GSK3α抑制作为干性检查点的功能具有普适性。
6. 模型更新：提出GSK3α作为“干性检查点”，其抑制作用“允许”而非“指令”干性，通过缓冲分化信号和状态转换来稳定干细胞身份。

背景：多能干细胞状态的异质性与共享机制

已知：

• mESCs代表“原始”（naïve）多能态，贡献嵌合体，在2i（PD0325901 + CHIR99021，抑制FGF/MEK并激活WNT）或LIF + 血清中自我更新。
• mEpiSCs代表“始发”（primed）多能态，不贡献嵌合体，需要activin A + bFGF + XAV939（AFX）维持。
• 已建立的转向：mESC可通过AFX转向mEpiSC状态，但反向极为罕见，显示出不对称的发育潜能。

未解问题：

• 尽管这两种PSC类型依赖不同的信号通路，它们是否共享支持自我更新的内在机制？
• 能否发现一种能够同时稳定两种状态的“共同调节因子”？

本研究的创新：

• 通过小分子筛选识别出GSK3α作为一个新的节点，其选择性抑制可以使两种状态共存。
• 开发了BI条件（BRD0705 + IWR1），在同一培养体系中维持两种不同的PSC身份。

核心结果

1. 筛选鉴定GSK3α作为干性调节因子

mESC筛选：在N2B27 + PD0325901（消除FGF/ERK信号）条件下筛选维持mESC集落形成的小分子 → 鉴定出BRD0705。

• BRD0705：一种选择性GSK3α抑制剂（此前在AML中报道）。
• 单独BRD0705足以在N2B27 + PD03中长期维持mESC自我更新（>10代），保持多能性标记物表达，并在返回2iL时完全可逆。
• 在N2B27 + BRD0705条件下成功衍生新的mESC系。

mEpiSC筛选：在AFX条件下筛选 → BRD0705再次成为候选，但单独作用仅支持短期维持。

• 协同因子筛选：发现IWR1（一种tankyrase抑制剂，抑制WNT信号）与BRD0705协同作用，在BI条件下长期维持mEpiSCs（>10代）。

2. BI允许两种多能状态的共存

共同培养实验：

• RFP标记的mESCs和GFP标记的mEpiSCs在BI中共同培养1个月以上。
• 两种细胞均稳健增殖，并保持其独特的标记物：mESCs表达Rex1高、Fgf5低；mEpiSCs表达Rex1低、Fgf5高。
• 抗生素选择（Zeocin富集RFP+mESCs；Puromycin富集GFP+mEpiSCs）证实了共同培养群体中两个谱系的稳定维持。

单细胞RNA测序验证：

• 共同培养的RFP+和GFP+细胞在UMAP中形成不同的簇。
• 原始标记物（Esrrb、Tbx3、Prdm14）在RFP+簇中富集；始发标记物（Fgf5）在GFP+簇中富集。
• 投影到小鼠胚胎数据：RFP+细胞与E3.5胚胎对齐（原始态）；GFP+细胞与E5.5-E6.5上胚层对齐（始发态）。

表观遗传分析：

• CUT&Tag for H3K4me3, H3K27ac, H3K27me3显示共同培养的mESCs和mEpiSCs保留了其独特的染色质状态，分别与2i培养的ESCs和AFX培养的EpiSCs相似。
• 二价基因谱与已发表数据集高度一致，证明在BI长期培养中发育身份的稳定性。

3. 机制：β-catenin非依赖，PI3K/AKT/mTOR轴驱动

靶点确认：

• 在Gsk3α–/–和Gsk3β–/– mESCs中：BRD0705维持Gsk3β–/–而非Gsk3α–/–的自我更新。
• Gsk3α–/– + GSK3α-K148R（激酶失活）mESCs：在DMEM + 10% FBS中无需抑制剂即可维持未分化状态，证实激酶活性是关键。
• 化学遗传学：GSK3α-AS（对3MB-PP1敏感的突变体）在3MB-PP1存在下维持mESC自我更新，而GSK3β-AS则不能，进一步确认GSK3α的特异性。

信号通路：

• BRD0705处理mESCs后，β-catenin蛋白水平未升高，且β-catenin敲除不影响BRD0705维持自我更新的能力，表明不依赖经典WNT信号。
• 磷酸化蛋白质组学显示BRD0705激活PI3K/AKT/mTOR通路；AKT抑制剂MK-2206阻断BRD0705的维持作用，而mTOR激活剂MHY1485可部分替代BRD0705。
• 在mEpiSCs中，BRD0705同样激活AKT/mTOR，且AKT抑制剂可阻断其维持作用。

4. 跨细胞类型适用性

• 形成态干细胞：BI条件维持了形成态干细胞（EpiL、EpiSC-like）的自我更新，这些细胞在AFX中无法长期培养。
• 神经干细胞：BI条件维持了SOX1+神经干细胞的自我更新，而AFX条件则不能。

讨论与展望

本研究将GSK3α确立为一种“干性检查点”，其选择性抑制能够稳定多种干细胞状态。与广谱GSK3抑制剂CHIR99021不同，BRD0705通过β-catenin非依赖的PI3K/AKT/mTOR轴发挥作用，避免了WNT过度激活导致的分化。BI条件为研究多能性状态转换和发育潜能提供了独特平台，未来可探索其在人类PSC中的应用，以及GSK3α在疾病模型中的潜在作用。