近日，中科院天津工业生物技术研究所孙际宾课题组通过体外多酶反应系统识别关键酶提高了L-苯丙氨酸的产量，该研究成果《Improving the Production of L-Phenylalanine by Identifying Key Enzymes Through Multi-Enzyme Reaction System in Vitro》发表在近期的《Scientific Reports》杂志。

L-苯丙氨酸对人类和大部分牲畜来说是一种重要的氨基酸。它可以应用于饲料、食品添加剂、味道增强剂、药物、膳食补充剂、保健品以及化妆品成份。特别是，L-苯丙氨酸可以用于生产在世界范围内的需求量稳定增长的甜味剂阿斯巴甜。目前，L-苯丙氨酸由化学合成、酶催化或者微生物途径获得。近些年，通过微生物发酵，特别是利用具有高生长速率以及确定的良好生理特性的大肠杆菌代谢工程菌株来生产L-苯丙酮酸变得越来越热门。

L-苯丙氨酸的生物合成和调控在大肠杆菌中已经被广泛地研究。莽草酸途径是L-苯丙氨酸生产的主要来源。两个莽草酸激酶，AroK和AroL，催化莽草酸和ATP合成莽草酸-3-磷酸（S3P）。aroL的表达受到以酪氨酸或色氨酸为辅阻遏物的TyrR的调控。和AroL相反，细胞内AroK的活性不受细胞外芳香族氨基酸的量以及tyrR基因产物水平的影响。5-烯醇丙酮酰莽草酸-3-磷酸合成酶（AroA）催化磷酸烯醇式丙酮酸（PEP）去磷酸的烯醇丙酮酰转移到S3P的5号C原子的羟基上生成5-烯醇丙酮酰莽草酸-3-磷酸（EPSP）。这是一个引入三碳片段成为苯丙酮酸侧链的加成-消除反应。分支酸合成酶（AroC）催化EPSP转化生成分支酸（CHA），CHA是三个芳香族氨基酸生物合成末端途径的起始底物。双功能分支酸变位酶/预苯酸脱水酶（PheA）负责催化苯丙氨酸生物合成的第二个步骤。这个天然的酶是有两个完全相同的亚基组成的二聚物，并且这两个亚基各自包含了一个脱水酶活性位点、一个变位酶活性位点和一个苯丙氨酸锚定位点。L-苯丙氨酸能通过变构效应反馈抑制这个酶的分支酸变位酶活性和预苯酸脱水酶活性。最后，一个酪氨酸可阻遏的芳香族氨基酸氨基转移酶（TyrB）催化L-谷氨酸和苯丙酮酸的转氨基作用来产生L-苯丙氨酸。

在这项工作中，研究者们开发了一个能够直接定量研究大肠杆菌中苯丙氨酸生物合成的体外系统。莽草酸途径中六个酶（AroK、AroL、AroA、AroC、PheA和TyrB）的绝对浓度通过一个定量的蛋白质组学方法和体外酶的滴定实验来测定。这六个酶体外反应系统的重构被建立以及它们对生成苯丙氨酸的影响也被测试。结果显示，当AroL和AroA的浓度分别提高2.5倍，苯丙氨酸的产量也分别提高了3和2.1倍。在一个产苯丙氨酸菌株中过表达AroA，在一个5 L的发酵罐中培养48 h后，苯丙氨酸的测定浓度达到了62.47 g/l，这个体内实验的结果和体外实验一致。这个定量的发现提供了检测一个特定代谢途径中潜在瓶颈的实用方法，以此可以确定哪个基因产物可以作为改造目标来提高期望产物的产量。