基因组编辑(Genome Editing)又称基因编辑,是基因工程的一种,指在活体基因组中进行DNA插入、删除、修改或替换的一项技术。其中,CRISPR/Cas9技术是目前基因编辑领域内应用最广的技术,该项技术一经诞生就被人们视为21世纪最为重要的生物发现之一。它稳定高效,已经被全球各地的研究人员应用在各种生物的基因修复、基因改造等技术中。 然而,这一技术从被发现到被广泛应用还不到10年时间。
什么是CRISPR/Cas? CRISPR (Clustered Regularly Interspaced Short Palindromic Repeats, 规律间隔成簇短回文重复序列),是存在于细菌和古菌基因组内的⼀段重复序列。 Cas (CRISPR-associated, CRISPR关联)蛋⽩,由总是出现在CRISPR区域附近的CRISPR关联基因编码的蛋白。Cas9是其中一种核酸内切酶,即能从核酸的内部切开双链的酶。 在自然界中,CRISPR/Cas系统能为细菌和古⽣菌提供对病毒和质粒的适应性免疫。现在,科学家通过对这个系统的重新设计和编程,可以精确识别并切断目标DNA,并诱导细胞进行DNA修复,最终实现基因敲除和基因修改。 细菌的CRISPR。钻石是“重复序列”,正方形是重复序列之间的“间隔成簇”,钻石与正方形有“规律”地在染色体内密集出现,而不是随机分布。 (图片来自《破天机——基因编辑及其控制演化的惊人力量》)
“发现”的历程 —— 1987年,这种特殊的重复序列被⾸次描述。⽇本大阪大学的科学家⽯野良纯发现⼤肠杆菌基因组DNA上有⼀段重复结构:有⼀段29碱基的序列反复出现了5次,两两之间都被32个碱基形成的看起来杂乱⽆章的序列隔开。 —— 1993,西班牙科学家Francisco Mojica在其他细菌和古菌中发现相似的重复序列,并将其命名为SRSR (Short Regularly Spaced Repeats, 短间隔重复序列)。 病毒DNA⽚段夹在细菌的重复结构中,就像是细菌在基因组⾥收藏了病毒不同⾓度的快照。凭什么仅靠记录⼀张病毒的快照,细菌就能够防御未来的病毒入侵呢? 现在我们知道,细菌在遭到病毒⼊侵后,能够把病毒基因的⼀⼩段存储到⾃⾝DNA中的CRISPR序列。当再次遇到病毒⼊侵时,细菌能够根据存写的⽚段识别病毒,将病毒的DNA切断⽽使之失效。 —— 从1993年到2005年间,Mojica发现,夹在重复序列之间的间隔序列与许多噬菌体(专门⼊侵细菌的病毒)的基因组序列信息⾼度⼀致,提出了CRISPR是细菌的⼀种适应性免疫机制的假设。 CRISPR的RNA分子如何在细胞内产生,并从长链RNA转化成更短的、只包含单一病毒配对RNA的片段? 细菌细胞把整个CRISPR序列翻译成一条长RNA链,一种酶把它切成更短的RNA链,它们长度一致,但间隔序列不同。这个过程把DNA中较长的重复序列变成了更短的RNA分子文库,每一个RNA分子都包含一段特定的噬菌体序列。 —— 2008年,美国伊利诺伊州西北⼤学的科学家Luciano Marraffni和Erik Sontheime证明了CRISPR的RNA分子的作⽤对象是DNA⽽⾮RNA,它们是通过碱基配对靶向剪切入侵病毒的DNA。 什么是PAM,PAM在CRISPR/Cas系统中起到什么作用? PAM(Protospacer Adjacent Motif)是入侵病毒的一部分,但不在细菌CRISPR中出现。如果目标DNA序列后面没有PAM序列,Cas9将不能对目标DNA进行干扰。PAM对靶向识别起着重要作用,它能帮助区分细菌自身和非自身DNA,从而防止细菌本身被CRISPR相关核酸酶锁定和破坏。 —— 2011年3月,瑞典于默奥⼤学的法国科学家Emmanuelle Charpentier领导的实验室在发现,除了crRNA外,还存在第⼆个RNA分子,他们称之为trans-activating crRNA (tracrRNA)。在化脓链球菌中,tracrRNA对于病毒的失活是必需的。tracrRNA与crRNA形成双链体,将Cas9蛋白(当时被称为Csn1蛋白)引导⾄其靶标。 (图片来自《破天机——基因编辑及其控制演化的惊人力量》)
2020年10月,这两位科学家被授予2020年诺贝尔化学奖,以表彰她们对“基因剪刀”CRISPR/Cas9的贡献。 (图片来自 nobelprize.org)
参考文献 1.王立铭. 上帝的手术刀——基因编辑简史[M]. 浙江: 浙江人民出版社, 2017. 2.[美] 詹尼佛·A.杜德娜、[美]塞缪尔·H·斯坦伯格. 破天机——基因编辑及其控制演化的惊人力量[M]. 湖南: 湖南科学技术出版社, 2020. 无锡耐思生命科技股份有限公司 商家主页 地址:江苏省无锡市锡达路530号 |