责编：西早同学 （浙江大学 博士生）

排版：X

编者按：

2019年神经环路示踪技术专题研讨会暨第四届神经环路示踪技术全国培训班 于2019年4月16日—21日在中科院武汉物理与数学研究所隆重召开。会议依托中科院物数所和武汉光电国家研究中心等单位，汇聚国内在工具病毒和光学成像技术上的顶尖力量，邀请40余位国内业内专家学者作为嘉宾分享神经环路相关研究的最新成果，吸引了全国近300名科研人员参加。继《听说神经科学家每天都在打病毒》、《2019年神经环路示踪技术专题研讨会——培训班篇》之后，脑人言继续为您带来本届研讨会的专题报道。本文将从环路研究精细化、环路与分子机制研究关系及工具病毒与环路研究技术进展三方面总结此次研讨会内容。

环路研究精细化

我们要关注哪个脑区的哪个亚区跟谁相连，相连的神经元亚群是什么。

——徐富强研究员

大会邀请了王建枝教授（华中科技大学长江学者特聘教授）分享最新成果，王建枝教授的一个重要研究方向是负性情绪（如焦虑、抑郁、恐惧）的产生及其损伤认知功能的机制。2013年，Felix–Ortiz等科学家利用顺向示踪技术研究发现并首次报道：杏仁核基底外侧核（BL）有直接的纤维投射到腹侧海马的CA1区域（vCA1），激活这条通路可以导致小鼠的焦虑样行为。而2016年王建枝教授团队与中科院武汉物数所徐富强研究员团队合作，利用嗜神经病毒环路示踪技术发现更多的联系主要是从基底外侧杏仁核后部（BLP）的锥体神经元发出投射到vCA1（Ying Yang, et al., Nature Communications, 2016）。进一步的研究成果发现同一脑区不同亚区的谷氨酸神经元投射到下游同一脑区的不同位置，且具有不同功能。

会议同时邀请到了李晓明教授（浙江大学长江学者特聘教授），李晓明教授多年来从事神经系统疾病的临床、教学和科研工作。本次大会李晓明教授分享了2019年最新三篇发表在Nature Medicine、Neuron、Nature Neurosci 的研究工作，内容有关于GABA能神经元、谷氨酸能神经元相关的神经环路研究。下面简要介绍报告部分内容：

基底外侧杏仁核（BLA）脑区谷氨酸能神经元投射到伏隔核（NAc）到底是参与厌恶还是奖赏一直以来有争议，过去将谷氨酸能神经元看作一种细胞类型，而李晓明教授团队发现实际上谷氨酸神经元中也存在亚群，甚至细胞位置不一样功能也不一样，即使投射到一个脑区也有可能最终到达不同亚区或不同类型神经元，从而介导不同甚至是相反的作用。举例来说，用神经肽CCK作为genetic marker，发现63.3%的BLA谷氨酸能神经元表达CCK，剩余36.7%为non-CCK 神经元。而这两类谷氨酸神经元都投射到NAc脑区，但编码的却是相反的情绪。原因就在于NAc脑区大部分都是MSNs神经元（medium spiny neurons），可细分为表达多巴胺D1受体和表达多巴胺D2受体两种。同样是BLA谷氨酸神经元到NAc脑区的投射就可分为CCK（BLA） -D2(NAcc) 及 non-CCK(BLA)-D1(NAcc)两种作用不同的功能连接。

(A) BLA谷氨酸神经元被标记为红色，从左到右三幅图为BLA的前中后端，第一排为投射到NAc脑区D1神经元的BLA神经元分布，第二排为投射到NAc脑区D2神经元的BLA神经元分布，可以看到二者分布即使在亚区内也并不完全均一。 (B)全细胞电流钳记录D2+与D2-细胞获得的I–V曲线揭示二者差别很大。（Chenjie Shen, et al., Nature Medicine, 2019）

这两位国内顶尖学者先后发言，分享的研究工作不约而同关注了亚脑区和连接细胞亚群。会议主持徐富强研究员为年轻科研工作者总结道：要学习前辈的优秀经验，我们要关注哪个脑区的哪个亚区跟谁相连，相连的神经元亚群是什么。实验工作精细一些，可以是脑区不同亚区、不同连接、不同神经元亚类的组合

神经环路研究思路总结 （图片来源：作者根据嘉宾演示文稿制作）

神经环路、分子机制两条腿走路

A molecular understanding of the brain is truly necessary.

（Thomas C.Südhof., Neuron, 2017）

神经环路研究与分子机制研究要两条腿走路。

——会议嘉宾周涛研究员（中科院深圳先进技术研究院）

环路层面是解析神经网络必不可少的重要方向，而落实到分子机制研究能够切实地找到药物靶点，实现疾病机制的基础研究与临床治疗的对接。二者促进，共同推进神经科学的发展。

会议嘉宾曹罡教授（华中农业大学楚天学者特聘教授）在分享工作成果中提到整合脑图谱概念，就是将环路信息与分子信息整合在一起两条腿走路。我们知道同一脑区的神经元能够投射到不同的脑区，有的甚至能投射到多个下游脑区，这些神经元遗传信息是相同的，其功能不同有可能是由于环境不同、环路位置不同导致基因表达存在差异。构建这些差异图谱就是构建表观遗传学图谱，寻找神经元之间在DNA甲基化、组蛋白修饰、染色体三维结构等方面的差异，这些差异与疾病息息相关。将基因表达信息和环路、疾病放在一个图谱中整合，从而获取三者的相互关系。这项工作对示踪病毒、单细胞分辨率神经环路系统等技术的进一步发展提出了需求。一些特异环路的基因表达谱和表观组学图谱工作已经有较好的进展。

图片来源：作者根据曹罡教授会议报告制作

除此之外，曹罡教授在报告中提到连接组学（Connectome，致力于对脑的区域连接组和神经元连接组的研究）的发展让神经科学家认可大脑神经环路的连接信息能够帮助开发人工智能。但在现今分辨率下的神经环路研究成果还不能完全揭示大脑是如何进行如此快速、高效而低耗的运算。而病毒示踪技术结合原位测序技术是提高分辨率的方法之一，运用原位测序将神经元的连接问题转化为测序问题。

图片来源：曹罡教授会议演示文稿

具体来说，曹罡教授及合作团队运用反向遗传学系统改造病毒，使其带上不同的barcode（可以想象为不同的条形码，实质为不同的ATCG核酸序列），通过病毒跨突触传播将这些barcode表达在病毒侵染的神经细胞中。根据原位测序获得神经元被标记的信息，可得出投射信息、细胞分类及位置分布信息。如下图选取了类似报道已发表工作，国内华中农业曹罡教授团队也正在做这样的工作。曹罡教授提到，测序得出的图谱信息为计算得出，还需要进一步在中高通量单细胞分辨率成像系统中进行验证。

右图不同颜色代表不同类型神经元（Xiao Wang, et al., Science, 2018）

技术进展推动环路研究跨越发展

病毒标记技术国内发展水平在国际上已经很有优势。

——会议嘉宾龚辉教授（华中科技大学光电国家研究中心）

近年来，由于交叉学科的渗透和一些关键技术的突破，使科学家能够一定程度上在神经环路水平对各种脑功能进行精细解析。

——《强人工智能时代 一定需要脑科学支撑》段树民院士答记者问

载体和元件

工具病毒的高速发展为神经环路示踪带来了极大便利，作为载体使用能够很好地搭载荧光蛋白、碱基barcode（前文提到）、光敏感通道及钙指示剂蛋白等。工具病毒种类多样，可与Cre-lox、Flp-FRT系统配套使用，也可将不同病毒组合使用。但目前工具病毒仍有一些不足，比如不同的病毒有不同嗜性，意味着病毒的侵染带有一定偏好。如下图A 所示，rAAV-retro倾向于感染皮层细胞，图B-C所示不同病毒即使是感染了同一个位置，侵染的细胞亚群也有区别。

病毒的嗜性有区别（Leqiang Sun, et al., Molecular Neurodegeneration, 2019）

除此之外，常用的逆向跨单突触工具狂犬病毒（RV）的毒性较大，不论是对注射位点还是投射位点，有证据证明感染不到两周的时间就可以改变细胞的基因表达谱，是亟待解决的问题之一。不过我国工具病毒的研究发展日新月异，国内包括武汉中科院物数所在内的众研究团队实力强劲，相信很快就可以攻克这些难题。

另外要提到的是传统的钙指示剂蛋白GCaMP，据报道GCaMP有很多副作用且具有破坏性，会进入细胞核内干扰正常的核内基因表达。会议嘉宾刘晓冬教授（北京航空航天大学）团队对GCaMP进行了优化，能够有效阻止该蛋白入核，从而保护神经元正常基因表达，并命名为GCaMP-X蛋白。期待这项研究能早日为其他广大的神经环路研究者使用。

中高通量单细胞分辨率环路精准光学成像技术

环路研究者总是希望能看见、看清、看全、看懂大脑的神经结构。关于脑的成像目前有三种方式，分别为磁共振、电镜和光学成像，前二者的一些短板（磁共振分辨率太低、电镜精度很高但是成像区域太小）使得光学成像成为神经环路研究的一项主要成像技术。而目前的共聚焦（confocal）、双光子（two-photon）显微成像在Z轴上的不足限制了全脑范围的环路追踪。

图片来源：龚辉教授会议演示文稿

在这样的挑战下，发展全脑介观的高通量单细胞分辨率光学成像系统至关重要。会议邀请龚辉教授（华中科技大学光电国家研究中心）分享其团队开发的MOST/fMOST系统相关工作。MOST/fMOST系统能够在三天内实现一个小鼠的全脑神经元成像，精度达到0.32×0.21×2.0μm3。这一系统能很好地研究纳米、微米级别的神经元细胞的类型和活动，既能反映出全脑情况，又能反映神经元精细结构甚至神经联接情况。

三维全脑图谱截取部分，神经元形态清晰可见

（Hui Gong, et al., Nature Communication, 2016）

运用这套系统进行全脑追踪首先需要根据需求选择方法标记神经元（Labeling），然后根据标记方式选用MOST（适用于尼氏染色、高尔基染色）或fMOST（适用于荧光标记）系统成像（Visualization），最后再进行全脑追踪神经元（Tracing）、重构（Reconstruction）。fMOST系统还能够自动收片，方便进行后续如免疫组化等实验。不过由于神经元形态非常复杂，神经元全脑投射的自动追踪还未实现，现以手动追踪为主。

MOST/fMOST概览（Parekh R, et al., Neuron, 2013）

会议还邀请了毕国强教授（中国科学技术大学长江学者特聘教授）分享其团队自主开发的VISoR系统。VISoR系统较之fMOST成像时间更短，精度略低。适合拍较大的样品如猴脑，且能与几乎所有的标记方法搭配。除此之外，这项技术能够很好的显示神经元的活动痕迹，比如用c-fos基因标记，就能检测到在固定一小时前活动的神经元。在实验动物的一些行为后取脑处理，就可以得到细胞精度的哪些脑区的神经元被激活的信息以供进一步研究。

神经递质探针

神经递质是突触连接信息传递的重要媒介，监测神经递质释放的方法很多种，但存在着各种各样的缺点。大会邀请了李毓龙研究员（北京大学）分享最新成果，其团队开发了一种灵敏、特异、可遗传编码的神经递质探针，能够实现细胞特异性且实时灵敏地对特定的神经递质在特定行为中的动态变化进行追踪，入选2018年度中国生命科学十大进展。

图片来源：李毓龙研究员会议演示文稿

这类探针的设计是依据许多神经递质膜受体是G蛋白偶联受体（GPCR），该探针将一个能够感受GPCR构象变化的荧光蛋白与受体相连，将受体在被神经递质激活后的构象变化转变为荧光蛋白荧光信号的变化，进而反映对应神经递质的浓度变化。目前李毓龙团队已经成功开发乙酰胆碱、多巴胺、去甲肾上腺素等多种神经递质探针。

虽然神经递质可分为不同类别，但是它们的受体结构并不是天差地别，相反很有规律，同类别的神经递质受体具有类似性。解析这些受体类别的结构、设计出新的神经递质探针工作将大有可为。神经递质探针这项新技术必然会带来新的发现，综合这些新兴技术的发展，中国科学家在这些新的技术上的进步将有力推动环路研究向前发展！

神经递质的分类和其受体的构象分类

图片来源：李毓龙研究员会议演示文稿

结  语

正如神经生物学家、中国神经科学学会理事长段树民院士18年接受采访中所说的：脑科学的研究很久以来主要集中在微观和宏观层面，如在分子细胞水平我们已经较清楚神经细胞是如何产生、传递和加工神经信息的，在系统行为水平，我们发现很多重要的现象和规律，比如视觉、听觉、运动、情绪等的控制和调制中枢在大脑的哪个位置。但是我们仍然不能解释大脑具体是如何工作以产生这些奇妙的功能，主要我们对于介观层面神经环路（或神经网络）如何工作还了解太少。

至2019年，我国的神经环路研究发展如火如荼、成果涌现，2019年神经环路示踪技术专题研讨会已经是系列会议成功举办的第四届。会议上群英璀璨、八方汇集，四届参会人员共计近2000人，足见我国环路研究队伍之壮大。近年来在脑科学研究领域中，交叉学科的渗透，及光遗传学、神经细胞连接追踪和解析、单细胞测序和标记以及克隆猴等一批关键技术技术突破都蕴含着中国科学家的智慧。可以预期，脑科学的一些重要基本问题可能在不远的将来取得重大突破。