神经突触是大脑中众多神经元之间信息传递和存储的最基本的结构与功能单元。突触的异常则可能是导致如抑郁症和阿尔茨海默病等精神与神经疾病的起源。精确解析突触的蛋白分子结构和组织架构、及其在神经活动或异常过程中的变化是解密大脑奥妙的一个关键环节，也是脑科学与脑疾病研究中最基础的核心研究方向之一。由于缺乏有效的研究手段，神经突触在很大程度上仍旧是一个黑盒子。冷冻电镜（CryoEM）技术的快速发展，一方面使得众多通过分离纯化后的蛋白质等生物大分子近原子分辨三维结构得以解析，另一方面，基于最新的冷冻电镜断层三维成像技术（CryoET）能够对保存在近生理状态下细胞和组织样本进行纳米分辨率的三维成像，为在神经突触及其它细胞区室中原位解析蛋白质分子结构和组织架构带来了新的契机。

2020年11月2日，中国科学技术大学、中国科学院深圳先进技术研究院双聘教授毕国强和刘北明团队，与美国加州大学洛杉矶分校周正洪教授合作在Nature Neuroscience杂志上发表文章Mesophasic organization of GABAA receptors in hippocampal inhibitory synapses，通过发展前沿冷冻电镜断层三维成像技术，首次解析了抑制性突触中GABAA受体的原位三维结构，并阐释了GABAA受体和支架蛋白在抑制性突触中具有层级化的介态相分离的组织规则。

毕国强教授多年来着重于发展用于突触、神经网络及全脑尺度解析的前沿显微成像技术，自从2007年回国后，核心工作之一即是与周正洪教授和匹兹堡大学章佩君教授开展合作，发展CryoET原位三维成像技术，重点应用于突触结构与功能研究。毕国强教授与张小康、陶长路、刘云涛等学生一起，经过长达十年的艰苦攻关，研发了新型冷冻光电关联显微成像技术，在国际上开创性地开展了基于冷冻电镜与关联显微成像技术的神经突触超微结构与功能研究，首次利用CryoET解析了完整神经突触的三维结构，并实现了对中枢神经系统中两类最主要突触-兴奋性与抑制性突触的精确区分以及结构特征的定量化分析【1-4】。

图1. 冷冻电镜断层原位成像技术解析神经突触受体蛋白原位结构与组织分布

在此基础上，研究团队发展了一种基于过采样与自动分类的冷冻电镜断层三维成像亚区域图像处理方法，实现了对细胞断层三维重构图像中无标记和无模板依赖的蛋白质自动识别和三维重构分析。基于这一方法，研究团队实现了对抑制性突触中GABAA受体的自动化识别并解析了其19Å分辨率的原位三维结构，这是目前已报道的首个突触原位受体蛋白结构。进一步，通过对GABAA受体在突触中的空间分布进行分析，发现这些受体在抑制性突触中呈现层级状的组织分布特性：GABAA受体之间可以形成具有距离固定（11nm间距）而相对角度可变的双分子复合物；这种双分子复合物进一步组成具有较低熵并且具备自组织特性的二维网络；最后形成具有清晰边界并介于固、液之间的介态相分离状态（mesophasic organization）。通过对GABAA受体的对应的胞内区域进行局部亚区域分类与平均分析和Monte-Carlo模拟分析表明，受体蛋白的这种组织形式可以通过突触后支架蛋白和受体之间的灵活相互作用而形成。

图2. 抑制性突触中受体等蛋白分子、细胞器等超微结构的三维可视化(图片版权：陶长路、刘云涛、毕国强；图片制作：王国燕、马燕兵)

受体分子与支架蛋白的这种半稳定性组织分布特征，否定了早期关于抑制性突触中受体蛋白规则锚定在支架蛋白所形成稳定的六边形网格上的推测；另一方面，GABAA受体在相分离边界内相对均匀分布的特性，也不同于基于超分辨光学成像所发现的兴奋性突触中受体蛋白具有局部纳米域分布的特性。抑制性突触中受体分子与支架蛋白的这种介态自组织形式，使得突触同时具备了稳定性和可变性，这一特性从分子组织结构层面很好地解释了学习与记忆的突触机理。

本研究中， GABAA受体原位三维结构的首次解析，为受体蛋白原位高分辨解析以及相应药物作用机理和治疗药物开发研究奠定了基础；对抑制性突触分子组织架构的解析表明利用冷冻电镜断层成像技术对突触这一黑匣子的解密迈出了关键的一步。

本论文共同第一作者为中国科学技术大学博士生刘云涛（现美国加州大学洛杉矶分校博士后）、博士后陶长路（现中科院深圳先进技术研究院副研究员）和中科院深圳先进技术研究院正高级工程师张小康，通讯作者为刘北明教授、周正洪教授和毕国强教授。江苏大学夏文君副教授完成了其中数学建模和计算模拟工作。毕国强教授领衔的团队依托中国科大合肥微尺度国家研究中心与中科院深圳先进院成立的脑信息研究中心现招聘博士后、研究助理和研究生（包括客座学生），详见文末。

专家点评

张明杰（香港科技大学，中国科学院院士）

突触信号的高效传递依赖于突触后膜致密区（PSD）独特的构架和复杂的分子组成。毕国强团队和周正洪团队再次联手利用冷冻电子断层成像（CryoET）技术，在神经突触原位观察到致密区中受体和支架蛋白的组织方式，并提供了精准的GABAA受体的结构信息和分布特征 。通过分析膜上受体的分布，该研究进一步指出在抑制性突触后膜，GABAA受体形成一种有明显界面的聚集体锚定在突触后膜上，这种自组装的GABAA受体聚集体介于无序的液态和完全有序的固态之间，和通过液-液相变而形成的聚集体非常吻合。非常有意思的是GABAA受体聚集体所在的膜下面有一层～5纳米厚的致密层，作者认为该致密层可能是由支架蛋白gephyrin聚合而成，进而一个由GABAA受体和支架蛋白相互作用、通过液-液相变而形成抑制性突触后膜致密区（iPSD）的模型跃然纸上。这种通过相变自组装方式能使膜上受体相对稳定地集中在致密区并具有一定的可塑性。

关于相分离的研究是近年来的热点，然而对其生物学意义的解答却受限于复杂而模糊的分子机制，很多领域更是缺乏直接的体内证据，刘、周、毕团队的工作非常直观地呈现了iPSD在神经突触原位存在的方式和形成的机制。无独有偶张明杰课题组同日在Cell Research杂志上发表的关于抑制性突触后膜致密区（iPSD）中GlyR/GABAA受体与支架蛋白gephyrin相分离研究的发现和刘、周、毕团队的电镜观察结果高度吻合，两个完全独立的研究相辅相成、从不同的角度共同揭示了iPSD形成的模式及对膜上受体的动态富集机制。长久以来，关于PSD的研究多集中于兴奋性突触，而对抑制性突触知之甚少。刘、周、毕团队的工作除了为iPSD形成机制的研究提供了关键的结构基础，同时也为相分离现象的解析建立了新的技术手段。

专家点评

竺淑佳（中国科学院脑科学与智能技术卓越创新中心）

离子通道广泛表达在神经突触膜上，是神经信号快速传递的重要物质基础。解析原子/分子分辨率的关键离子通道超微结构一直是神经生物学的前沿热点。目前最普遍是利用纯化的重组蛋白，采用冷冻电镜单颗粒成像技术SPA（Single Particle Analysis），可实现3-5 Å分辨率。鉴于离子通道组装及构象的多样性、组织制样的复杂性，用透射电镜看到原位组织离子通道的超微结构依然困难重重。本研究中，中科大毕国强教授、Pak-Ming Lau教授和UCLA周正洪（Z.Hong Zhou）教授合作，利用冷冻电镜断层成像技术Cryo-ET（Cryo-Electron Tomography）与光电联合技术的结合，通过对培养海马神经元上抑制性突触超微结构的精细分析，以比超高分辨光学成像更高一个数量级的19 Å分辨率，成功正视了GABAA受体在原位突触后膜上的三维结构。他们进一步分析了GABAA受体在突触膜表面的聚集形式、分布网络、与突触后膜支架蛋白相互作用、及与突触前囊泡释放之间潜在的偶联机制。希望毕国强教授团队能将开发的方法应用到更多神经系统（包括兴奋性）离子通道结构的原位解析中，为生理或病理状态下离子通道的功能及药理学验证提供理论基础。值得一提的是，Nature在10月份报道了由英国MRC实验室Radu Aricescu和Sjors Scheres教授合作发表的SPA突破性工作，其中将GABAA受体解析到1.7 Å的超高分辨率【5】。期待在不久的将来，离子通道的研究将SPA、cryo-ET及功能验证有效整合起来，为突触传递及可塑性的分子机制提供原子分辨率的证据。

专家点评

李赛（清华大学生命学院研究员，长期从事高分辨冷冻电镜断层成像及囊膜病毒结构生物学相关研究）

PSD（Postsynaptic density，突触后致密区）位于突触后膜，是神经突触的重要组成部分。PSD被认为是在突触后膜集中和组织神经递质受体的超级结构。PSD也用作信号装置，例如，PSD中的激酶和磷酸酶被激活并从PSD中释放出来，从而改变位于树突棘中蛋白质的活性，或者被运送到细胞核来影响蛋白质的合成。PSD行使着快速、非对称的信号传递功能。由于该区域汇集了上百种蛋白，在电镜下，PSD的密度较为明显，直径大约为250-500 纳米，厚度大约为25-50纳米。

针对PSD上蛋白组分、功能、结构、分布，及PSD本身形态的研究一直是神经生物学的热点。然而，由于PSD的多形性，以及其上蛋白尺寸较小，对其的高分辨成像及结构解析工作一直是个难点。超分辨荧光显微镜提供了良好的蛋白定位，但通常只能达到20nm左右的定位精度，加上荧光标记效率的问题仍旧无法达到定量解析PSD的要求；冷冻电镜可提供高分辨的成像，但由于缺乏特异性标记手段，又难以分辨PSD上面的蛋白分子。因此，解开PSD的谜题，还需要在冷冻电镜方法上有所创新。

A型GABA受体来自配体门控离子通道超级家族，呈现五聚，并以20根穿膜的a-helix锚定在细胞膜上。人源的GABAA受体的五个亚基一般由两个a基因、两个b基因及一个g基因编码，互相结构稍有不同。首个GABAA受体的五聚体结构在2014年由笔者当时在牛津大学结构生物学部的同事Paul Miller和A. Radu Aricescu通过晶体学方法解析至3 Å【6】。为获得稳定的GABAA受体五聚体复合物及晶体，Radu几乎孤注一掷，集中几乎所有的资源攻关。经历反复的失败并耗尽了所有的经费后，终于迎来柳暗花明，该晶体结构当时在神经生物学届引发了轰动。那一年也是冷冻电镜革命的开始。此后，Radu迅速向单颗粒冷冻电镜技术转型，并将课题组迁去剑桥LMB。在那里，他一发不可收拾，使用冷冻电镜解析了GABAA受体的一系列结构并在顶尖刊物发表【7,8】。他更是与Relion作者Scheres合作，使用冷冻电镜单颗粒法将GABA_A受体的结构推到了1.7 Å的惊人分辨率，作为方法学突破成果发表在今年10月的Nature上【5】。

经历了晶体学到冷冻电镜的转换，GABA_A受体复合物结构被愈发快速的解析，但这些结构均来源于体外表达的重组蛋白，人们对于它在神经突触上的原位结构、分布情况、互作关系等信息仍然知之甚少。中国科学技术大学毕国强团队与加州大学洛杉矶分校周正洪团队合作，开创性的使用冷冻电镜断层成像技术（cryo-ET）及子断层图像平均法（STA）对完整突触中的PSD区域进行高分辨三维成像及结构解析，成果揭示了PSD的形态，并在该区域确认了GABAAR的19Å分辨率结构及分布。

在该项目中，作者们从大鼠胚胎取得海马体，并在体外培养。作者们将细胞在金网上生长后使用投入式冷冻装置制样，并分别在使用VPP或无VPP的情况下对突触区域进行cryo-ET数据采集。为分辨不同类型突触PSD结构，作者们进行了光电联合成像，并确认在冷冻电镜下采集的其中一类为抑制性突触的PSD结构。

在观察这些tomogram数据的时候，作者们发现大量的五聚体密度，疑似为GABAAR。于是项目解析目标进一步明确为解析GABAAR的原位结构与分布。为准确找到这些GABAAR，作者们对PSD所在的突触后膜进行了细胞膜的建模以确认细胞膜的取向。随后，他们在膜的模型上种下种子，并保证这些种子的数量远远超过GABAAR的数量，通过这种过采样方法，绝大多数GABAAR有望被找到。接着，作者们使用Relion对围绕这些种子切下的子断层图像进行了仔细的分类和对齐计算，再利用膜的已知几何特征，对重叠或计算失误的子断层图像进行清除，并最终获得GABAAR的19Å分辨率原位结构。通过对一系列已知GABAAR体外重组结构的比对，该cryo-ET结构被认为和GABAAR-b3的结构【6】最为近似。

在获得原位结构后，作者们进一步对GABAAR在PSD的原位分布进行了分析。在计算GABAAR的相对位置后，邻近的GABAAR被发现以11 nm的典型距离间隔。并以GABAAR pair为基本单元组装成较为松散的网络分布在PSD上，并呈现分明的边界。作者们进一步推断，这些GABAAR形成的网络可能与突触后的支架蛋白及其他受体有相互作用，并与突触前的囊泡释放位点对齐。

GABA受体的结构一直是结构生物学、神经生物学和膜蛋白研究的热点。自2014年使用晶体学解析首个GABAAR结构，到当年迎来的冷冻电镜革命推动整个GABAAR结构生物学领域向冷冻电镜转型，到如今毕国强团队与周正洪团队结合冷冻电镜断层成像技术（cryo-ET）及子断层图像平均法（STA）揭示其原位结构。结构生物学技术的更新与发展趋势，从这6年间发表的GABAAR结构历程中可见一斑。当结构生物学届不再仅仅满足于体外重组蛋白的高分辨信息，而更渴望获得它们在原生环境下的全长天然结构及地理分布时，cryo-ET及STA 成为回答这些问题的主要高分辨手段。cryo-ET被应用在结构生物学中，可以回答很多独一无二的生物学问题，在笔者看来最吸引人的有四个：1）它带来丰富的、纳米级分辨率的生物背景(context)。比如生物大分子在原生环境中的拷贝数、分布规律、与其他分子的互作；2）它展示天然、原位的生物结构；3）它的三维原始数据特点为解析在体外难以重组表达的超大分子复合物带来可能；4）结合光电联合、聚焦离子束减薄等技术，它可以实现跨尺度高分辨成像，甚至可以从生物组织中获得纳米级分辨率三维信息。由于应用前景广阔，可拓展空间巨大，cryo-ET被誉为结构生物学的未来技术方向。然而，该方向技术分支较多、学习路线漫长、众多软硬件不够成熟，让众多即使有冷冻电镜积淀的初学者也浅尝辄止、望而却步。这篇文章的方法讨论部分篇幅详细，解答的生物问题新颖性较强，这展示着，毕国强团队与周正洪团队可谓是当之无愧的结构生物学先驱者。

【注，恰逢本文发表之际，李赛老师关于cryo-ET的科普综述文章在微信公众号返朴发表，李赛老师对cryo-ET技术的原理、发展历史与未来趋势有着非常深入独到的解读，详见：结构生物学的下一个突破：cryo-ET】

原文链接：

https://www.nature.com/articles/s41593-020-00729-w

参考文献

1. Tao, C. L., et al. (2018). "Differentiation and Characterization of Excitatory and Inhibitory Synapses by Cryo-electron Tomography and Correlative Microscopy."JNeurosci38(6): 1493-1510.

2. Tao, C. L., et al. (2018). "Accumulation of Dense Core Vesicles in Hippocampal Synapses Following Chronic Inactivity."Front Neuroanat12: 48.

3. Liu, Y. T., et al. (2019). "Postsynaptic protein organization revealed by electron microscopy."Curr Opin Struct Biol54: 152-160.

4. Sun, R., et al. (2019). "An efficient protocol of cryo-correlative light and electron microscopy for the study of neuronal synapses."Biophysics Reports5(3): 111-122.

5. Nakane, T., Kotecha, A., Sente, A., McMullan, G., Masiulis, S., Brown, P.M.G.E., Grigoras, I.T., Malinauskaite, L., Malinauskas, T., Miehling, J., et al. (2020). Single-particle cryo-EM at atomic resolution.Nature.

6. Miller, P.S., and Aricescu, A.R. (2014). Crystal structure of a human GABAA receptor.Nature512, 270-275.

7. Laverty, D., Desai, R., Uchanski, T., Masiulis, S., Stec, W.J., Malinauskas, T., Zivanov, J., Pardon, E., Steyaert, J., Miller, K.W., et al. (2019). Cryo-EM structure of the human alpha1beta3gamma2 GABAA receptor in a lipid bilayer.Nature565, 516-520.

8. Masiulis, S., Desai, R., Uchanski, T., Serna Martin, I., Laverty, D., Karia, D., Malinauskas, T., Zivanov, J., Pardon, E., Kotecha, A., et al. (2019). GABAA receptor signalling mechanisms revealed by structural pharmacology.Nature565, 454-459.