2．蛋白水解酶类

　　a：链霉蛋白酶是从链球菌（Streptomyces griseus）中分离到的一种丝氨酸酶和酸性蛋白酶的混合物。

　　b：自消化可消除DNA酶和RNA酶的污染，经自消化的链酶蛋白酶的配制方法如下：把该酶的粉末溶解于10mmol./l Tris·HCl(pH7.5)、10mmol/l NaCl中，配成20mg/ml浓度，于37℃温育1h。经消化的链霉蛋白酶分装成小份放在密封试管中，保存-20℃。

　　c：蛋白酶K是一种枯草蛋白酶类的高活性蛋白酶，从林伯氏白色念球菌（Tritirachium album Limber）中纯化得到。该酶有两个Ca²⁺结合位点，它们离酶的活性中心有一定距离，与催化机理并无直接关系。然而，如果从该酶中除去Ca²⁺，由于出现远程的结构变化，催化活性将丧失80%左右，但其剩余活性通常已足以降解在一般情况下污染酸制品的蛋白质。所以，蛋白酶K消化过程中通常加入EDTA（以抑制依赖于Mg²⁺的核酸酶的作用）。但是，如果要消化对蛋白酶K具有较强耐性的蛋白，如角蛋白一类，则可能需要使用含有1mmol/l Ca²⁺而不含EDTA的缓冲液。在消化完毕后、纯化核酸前要加入EGT（pH8.0）至终浓度为2mmol/L,以鳌合Ca²⁺。

　　3．无DNA酶的RNA酶

　　将胰RNA酶（RNA酶A）溶于10mmol/l Tris·HCl(pH7.5)、15mmol/l NaCl中，配成10mg/ml的浓度，于100℃加热15min，缓慢冷却至室温，分装成小份保存于-20℃。

　　四、常用抗生素溶液

抗生素

贮存液^a

工作浓度

浓度

保存条件

严紧型质粒

松弛型质粒 氨苄青霉素 50mg/ml(溶于水)

-20℃

20μg/ml

60μg/ml 羧苄青霉素 50mg/ml(溶于水)

-20℃

20μg/ml

60μg/ml 氯霉素 34mg/ml(溶于乙醇)

-20℃

25μg/ml

170μg/ml 卡那霉素 10mg/ml(溶于水)

-20℃

10μg/ml

50μg/ml 链霉素 10mg/ml(溶于水)

-20℃

10μg/ml

50μg/ml 四环素^b 5mg/ml(溶于乙醇)

-20℃

10μg/ml

50μg/ml

　　a：以水为溶剂的抗生素贮存液通过0.22μm滤器过滤除菌。以乙醇为溶剂的抗生素溶液无须除菌处理。所有抗生素溶液均应放于不透光的容器保存。

　　b：镁离子是四环素的拮抗剂，四环素抗性菌的筛选应使用不含镁盐的培养基（如LB培养基）。

　　五、常用贮存液的配制

　　1．30%丙烯酰胺溶液

　　【配制方法】

　　将29g丙烯酰胺和1g N，N’-亚甲双丙烯酰胺溶于总体积为60ml的水中。加热至37℃溶解之，补加水至终体积为100ml。用Nalgene滤器（0.45μm孔径）过滤除菌，查证该溶液的pH值应不大于7.0，置棕色瓶中保存于室温。

　　【注意】

　　丙烯酰胺具有很强的神经毒性并可以通过皮肤吸收，其作用具累积性。称量丙烯酰胺和亚甲双丙烯酰胺时应戴手套和面具。可认为聚丙烯酰胺无毒，但也应谨慎操作，因为它还可能会含有少量未聚合材料。

　　一些价格较低的丙烯酰胺和双丙烯酰胺通常含有一些金属离子，在丙烯酰胺贮存液中加入大约0.2体积的单床混合树脂（MB-1Mallinckrodt），搅拌过夜，然后用Whatman 1号滤纸过滤以纯化之。

　　在贮存期间，丙烯酰胺和双丙烯酰胺会缓慢转化成丙烯酰和双丙烯酸。

　　2．40%丙烯酰胺

　　【配制方法】

　　把380g丙烯酰胺（DNA测序级）和20g N，N’-亚甲双丙烯酰胺溶于总体积为600ml的蒸馏水中。继续按上述配制30%丙烯酰胺溶液的方法处理，但加热溶解后应以蒸馏水补足至终体积为1L。

　　【注意】

　　见上述配制30%丙烯酰胺的说明，40%丙烯酰胺溶液用于DNA序列测定。

　　3．放线菌素D溶液

　　【配制方法】

　　把20mg放线菌素D溶解于4ml 100%乙醇中，1：10稀释贮存液，用100%乙醇作空白对照读取OD⁴⁴⁰值。放线菌素D（分子量为1255）纯品在水溶液中的摩尔消化系数为21，900，故而1mg/ml的放线菌素D溶液在440nm处的吸光值为0.182，放线菌素D的贮存液应放在包有箔片的试管中，保存于-20℃。

　　【注意】

　　放线菌素D是致畸剂和致癌剂，配制该溶液时必须戴手套并在通风橱内操作，而不能在开放在实验桌面上进行，谨防吸入药粉或让其接触到眼睛或皮肤。

　　药厂提供的作治疗用途的放线菌素D制品常含有糖或盐等添加剂。只要通过测量贮存液在440nm波长处的光吸收确定放线菌素D的浓度，这类制品便可用于抑制自身引导作用。

　　4．0.1mol/L腺苷三磷酸（ATP）溶液

　　【配制方法】

　　在0.8ml水中溶解60mg ATP,用0.1mol/L NaOH调至pH值至7.0，用蒸馏水定容1ml，分装成小份保存于-70℃

　　5．10mol/L乙酸酰溶液

　　【配制方法】

　　把770g乙酸酰溶解于800ml水中，加水定容至1L后过滤除菌。

　　6．10%过硫酸铵溶液

　　【配制方法】

　　把1g过硫酸铵溶解于终量为10ml的水溶液中，该溶液可在4℃保存数周。

　　7．BCIP溶液

　　【配制方法】

　　把0.5g的5-溴-4-氯-3-吲哚磷酸二钠盐（BCIP）溶解于10ml 100%的二甲基甲酰胺中，保存于4℃

　　8．2×BES缓冲盐溶液

　　【配制方法】

　　用总体积90ml的蒸馏水溶解1.07g盐溶液BES[N，N-双（2-羟乙基）-2-氨基乙磺酸]、1.6g NaCl和0.027g Na₂HPO₄，室温下用HCl调节　该溶液的pH值至6.96、然后加入蒸馏水定容至100ml，用0.22μm滤器过滤除菌，分装成小份，保存于-20℃。

　　9．1mol/L CaCl₂溶液

　　【配制方法】

　　在200ml蒸馏水中溶解54g CaCl₂·6H₂O，用0.22μm滤器过滤除菌，分装成10ml小份贮存于-20℃。

　　【注意】

　　制备感受态细胞时，取出一小份解冻并用蒸馏水稀释至100ml，用Nalgene滤器（0.45μm孔径）过滤除菌，然后骤冷至0℃。

　　10．2.5mol/L CaCl₂溶液

　　【配制方法】

　　在20ml蒸馏水中溶解13.5g CaCl₂·6H₂O，用0.22μm滤器过滤除菌，分装成1ml小份贮存于-20℃。

　　11．1mol/L二硫苏糖醇（DTT）溶液

　　【配制方法】

　　用20ml 0.01mol/L乙酸钠溶液（pH5.2）溶解3.09g DTT，过滤除菌后分装成1ml小份贮存于-20℃。

　　【注意】

　　DTT或含有DTT的溶液不能进行高压处理。

　　12．脱氧核苷三磷酸（dNTP）溶液

　　【配制方法】

　　把每一种dNTP溶解于水至浓度各为100mmol/L左右，用微量移液器吸取0.05mol/l Tris碱分别调节　每一dNTP溶液的pH值7.0（用pH试纸检测），把中和后的每种dNTP溶液各取一份作适当稀释，在下表中给出的波长下读取光密度计算出每种dNTP的实际浓度，然后用水稀释成终浓度为50mmol/L的dNTP，分装成小份贮存于-70℃。

碱基

波长（nm）

消化系数（ε）[L/（mol·cm）]

A

259

1.54×10⁴

G

253

1.37×10⁴

C

271

9.10×10³

T

260

7.40×10³

　　比色杯光径为1cm时,吸光度=εM

　　13．0.5mol/l EDTA(pH8.0)溶液

　　【配制方法】

　　在800ml水中加入186.1g二水乙二胺四乙酸二钠（EDTA-Na·2H₂O），在磁力搅拌器上剧烈搅拌，用NaOH调节　溶液的pH值至8.0（约需20g NaOH颗粒）然后定容至1L，分装后高压灭菌备用。

　　【注意】

　　EDTA二钠盐需加入NaOH将溶液的pH值调至接近8.0，才能完全溶解。

　　14．溴化乙锭（10mg/ml溶液）

　　【配制方法】

　　在100ml水中加入1g溴化乙锭，磁力搅拌数小时以确保其完全溶解，然后用铝箔包裹容器或转移至棕色瓶中，保存于室温。

　　【注意】

　　小心：溴化乙锭是强诱变剂并有中度毒性，使用含有这种染料的溶液时务必戴上手套，称量染料时要戴面罩。

　　15．2×HEPES缓冲盐溶液

　　【配制方法】

　　用总量为90ml的蒸馏水溶解1.6g NaCl、0.074g KCl、0.027g Na₂PO₄·2H₂O、0.2g葡聚糖和1gHEPES，用0.5mol/l NaOH调节　pH值至7.05，再用蒸馏水定容至100ml。用0.22μm滤器过滤除菌，分装成5ml小份，贮存于-20℃。

　　16．IPTG溶液

　　【配制方法】

　　IPTG为异丙基硫代-β-D-半乳糖苷（分子量为238.3），在8ml蒸馏水中溶解2g IPTG后，用蒸馏水定容至10ml，用0.22μm滤器过滤除菌，分装成1ml小份贮存于-20℃。

　　17．1mol/L乙酸镁溶液

　　【配制方法】

　　在800ml水中溶解214.46g四水乙酸镁，用水定容至1L过滤除菌。