二、缓冲液

　　免疫细胞化学中应用的缓冲液种类较多，即使是同种缓冲液，其浓度、pH、离子强度等也常常不同。在此介绍几种最常用的缓冲液的配制。

　　1．0.2mol/L(pH7.4)磷酸盐缓冲液（Phosphate Buffer, PB）

　　试剂： NaH2PO4·2H2O

　　Na2HPO4·12H2O

　　配制方法：配制时，常先配制0.2mol/L的 NaH2PO4和0.2mol/L的Na2HPO4，两者按一定比例混合即成0.2mol/L的磷酸盐缓冲液（PB），根据需要可配制不同浓度的PB和PBS。

　　（1）0.2mol/L的 Na2HPO4；称取Na2HPO4.12H2o 31.2g(或 NaH2PO4·H2O 27.6g)加重蒸水至1000ml溶解。

　　（2）0.2mol/L的 Na2HPO4：称取NaHPO4.·12H2o 71.632g（或 Na2HPO4·7H2O 53.6g或 Na2HPO4·2H2o 35.6g）加重蒸水至1000ml溶解。

　　 （3）0.2mol/L pH7.4的PB的配制：取19ml 0.2mol/L的 NaH2PO4和81ml 0.2mol/L的 Na2HPO4·12H2O,充分混合即为0.2mol/L的PB（pH约为7.4～7.5）。若pH偏高或偏低，可通过改变二者的比例来加以调整，室温保存即可。

　　2．0.01mol/L磷酸盐缓冲生理盐水（Phosphate Buffered Saline, PBS）

　　试剂：0.2mol/L PB　　　50ml

　　NaCl 　　　　　　　　　8.5～9g(约0.15mol/L)

　　重蒸水 　　　　　　　　至1000ml

　　配制方法：称取NaCl 8.5～9g及0.2mol/L的PB 50ml，加入1000ml的容量瓶中，最后加重蒸水至1000ml，充分摇匀即可。若拟配制0.02mol/L的PBS，则PB量加倍即可，依此类推。

　　PB和PBS是免疫细胞化学实验中最为常用的缓冲液，0.01mol/L的PBS主要用于漂洗组织标本、稀释血清等，其pH应在7.25～7.35之间，否则需要调整。0.1mol/L的PB常用于配制固定液、蔗糖等。一般情况下，0.2mol/l PB的pH值稍高些，稀释成0.01mol/L的PBS时，常可达到要求的pH值，若需调整pH，通常也是调PB的pH。

　　3．Karasson –Schwlt’s磷酸盐缓冲液

　　试剂： NaH2PO4·H2O　　3.31g

　　Na2HPO4·7H2O　　　　　33.77g

　　重蒸水 　　　　　　　　至1000ml

　　配制方法：同前

　　该缓冲液主要用于配制Zamboni’s固定液。

　　4．0.5mol/L pH7.6的Tris- HCl缓冲液。

　　试剂：Tris(三羟甲基氨基甲烷)　　60.57g

　　1N HCl　　　　　　　　　　　　　约420ml

　　重蒸水 　　　　　　　　　　　　至1000ml

　　配制方法：先以少量重蒸水（300～500ml）溶解Tris,加入HCl后，用1N的HCl或1N的NaOH将pH调至7.6，最后加重蒸水至1000ml。此液为储备液，于4℃冰箱中保存。免疫细胞化学中常用的Tris-HCl缓冲液浓度为0.05mol/L，用时取储备液稀释10倍即可。

　　该液主要用于配制Tris缓冲生理盐水（TBS）、DAB显色液。

　　5．Tris缓冲生理盐水（Tris Buffered,Saline,TBS）

　　试剂：0.5mol/L Tris-HCl缓冲液　　　100ml

　　NaCl　　　　　　　　　　　　　　　3.5～9g(0.15mol/L)

　　重蒸水　　　　　　　　　　　　　　至1000ml

　　配制：先以重蒸水少许溶解NaCl,再加Tris-HCl缓冲液，最后加重蒸水至1000ml，充分摇匀使Tris终浓度为0.05mol/L。

　　TBS主要用于漂洗标本，常用于免疫酶技术中。

　　6．Tris-TBS(PBS)

　　试剂：Triton X-100　　　　　　　10ml(1%)或3ml(0.3%)

　　0.5mol/L Tris缓冲液（pH7.6）　　1000ml(50ml)或(0.2mol/L的PB)

　　NaCl　　　　　　　　　　　　　　8.5～9g

　　重蒸水　　　　　　　　　　　　　至1000ml

　　配制方法：先以重蒸水少许溶解NaCl后，加入Triton X-100及Tris缓冲液或（PB），最后加重蒸水至1000ml，充分摇匀。

　　该液常用浓度为1%及0.3%，前者主要用于漂洗标本，后者主要用于稀释血清。

　　7．0.1mol/L（pH7.4）二甲胂酸缓冲液

　　试剂：0.2mol/L二甲胂酸钠　　　　　　500ml

　　0.1N HCl　　　　　　　　　　　　　　28ml

　　蒸馏水　　　　　　　　　　　　　　　至1000ml

　　配制方法：先称取二甲胂酸钠（MW：214）42.8g,加蒸馏水至1000ml，使0.2mol/L的二甲胂酸钠溶液；再取HCl 1.7ml加蒸馏水至1000ml ,配成0.1N，最后 取0.2mol/L二甲胂酸钠溶液500ml及0.1n HCl 28ml混合，加蒸馏水至1000ml，即为0.1mol/L的二甲胂酸钠缓冲液。

　　8．几种常用的不同pH值缓冲液的配制表

　　（1）0.2mol/L磷酸盐缓冲液（pH5.7～8.0）

pH

0.2mol/L NaH2PO4(ml)

0.2mol/L Na2HPO4(ml)

5.7

93.5

6.5

5.8

92.0

8.0

5.9

90.0

10.0

6.0

87.7

12.3

6.1

85.0

15.0

6.2

81.5

18.5

6.3

77.5

22.5

6.4

73.5

26.5

6.5

68.5

31.5

6.6

62.5

37.5

6.7

56.5

43.5

6.8

51.0

49.0

6.9

45.0

55.0

7.0

39.0

61.0

7.1

33.0

67.0

7.2

28.0

72.0

7.3

23.0

67.0

7.4

19.0

81.0

7.5

16.0

84.0

7.6

13.0

87.0

7.7

10.5

89.5

7.8

8.5

91.5

7.9

7.0

93.0

8.0

5.3

94.7

　　(2)0.05mol/L Tris-HCl缓冲液（pH7.19～9.10）

pH

0.2mol/L Tris(ml)

0.2mol/L HCl(ml)

H2O

7.19

10.0

18.0

12.0

7.36

10.0

17.0

13.0

7.54

10.0

16.0

14.0

7.66

10.0

14.0

15.0

7.77

10.0

14.0

16.0

7.87

10.0

13.0

17.0

7.96

10.0

12.0

18.0

8.05

10.0

11.0

19.0

8.14

10.0

10.0

20.0

8.23

10.0

9.0

21.0

8.32

10.0

8.0

22.0

8.41

10.0

7.0

23.0

8.51

10.0

6.0

24.0

8.62

10.0

5.0

25.0

8.74

10.0

4.0

26.0

8.92

10.0

3.0

27.0

9.10

10.0

2.0

28.0

　　(3)0.2mol/L醋酸盐缓冲液（pH3.6～5.6）

pH

0.2mol/L醋酸（ml）

0.2mol/L醋酸钠（ml）

3.6

46.3

3.7

3.8

44.0

6.0

4.0

41.0

9.0

4.2

36.8

13.2

4.4

30.5

19.5

4.6

25.5

24.5

4.8

20.0

30.0

5.0

14.8

35.2

5.2

10.5

39.5

5.4

8.8

41.2

5.6

4.8

45.2

　　(4)0.1mol/L二甲胂酸钠缓冲液（pH5.0～7.4）

pH

0.2mol/L二甲胂酸钠（ml）

0.2N HCl(ml)

蒸馏水

5.0

25

23.5

51.5

5.2

25

22.5

52.5

5.4

25

21.5

53.5

5.6

25

19.6

55.5

5.8

25

17.4

57.5

6.0

25

14.8

60.3

6.2

25

11.9

63.1

6.4

25

9.2

65.8

6.6

25

6.7

68.3

6.8

25

4.7

70.3

7.0

25

3.2

71.8

7.2

25

2.1

72.9

7.4

25

1.4

73.6

　　注：HCI可由NCO3代替，配制成二甲胂酸钠-HNO3缓冲液。

　　（5）0.2mol/L碳酸盐缓冲液（pH9.2～10.7）

pH

0.2mol/L Na2CO3(ml)

0.2mol/L NaHCO3(ml)

9.2

4.0

46.0

9.3

7.5

42.5

9.4

9.5

40.5

9.5

13.0

37.0

9.6

16.0

34.0

9.7

19.5

30.5

9.8

22.0

28.0

9.9

25.0

25.0

10.0

27.5

22.5

10.1

30.0

20.0

10.2

33.0

17.0

10.3

35.5

14.5

10.4

38.5

11.5

10.5

40.5

9.5

10.6

42.5

7.5

10.7

45.0

5.0

　　三、显色液

　　免疫细胞化学中，由于抗原-抗体反应所形成的复合物本身无色，无法直接观察，因而需借助于某些化学基团的呈色作用，使其得以显示，以利于在显微镜下观察。常用的显色液有：