14C 5720年 0.155 －

　　3H 12.5年 0.0189 － ¹²⁵I 60天 － 0．035

　　131I 8.05天 0.608，0.335，0.250 0.364，0.637，0.722

　　大多数抗原分子中是不含碘的,引入碘原子就改变了抗原的分子结构，往往容易损伤抗原的免疫化学活性；且放射性碘的半衰期较短，标记物放置后因衰变使放射性降低，因而需要经常制备标记物或要求能定期提供放射性碘标记都能适用，放射性碘放出γ—射线，用一般晶体闪烁计数器就能获得较高效率而精确的测量，测量操作也很简单。由于这些突出的优点，目前在放射免疫分析中，使用放射性碘标记物最多。

　　从应用角度来看，¹³¹I和¹²⁵I又各有其优缺点，可根据实验的要求、仪器的条件和放射性碘制剂的规格等条件合理选用。但相对而言，¹²⁵I有较多的优点，一是半衰期适中，允许标记化合物的商品化及贮存应用一段时间；二是它只发射28keV能量的X射线和35keV能量的γ射线，而无β粒子，因而辐射自分解少，标记化合物有足够的稳定性。放射性碘适用于放射免疫分析许多对象（包括蛋白质、肽类、固醇类、核酸类以及环型核苷酸衍生物等）的标记，且操作简单，一般实验室都不难做到。

　　二、蛋白质与多肽激素的放射性碘标记

　　要制备高比度、高纯度与免疫化学活性好的标记物，首先要有高纯度、良好免疫活性的抗原。用作放射标记加网免疫分析的特异性，所以若用纯度不高的抗原作标记，则标记后必须采取适当的步骤除去杂质，以获得高纯度的标记物。标记对象的纯化应尽量采用温和的方法，否则在纯化操作中已受潜在性损伤的蛋白质（这时表面上活性可能还是良好的），再经标记反应时所受的损伤，活性就会显著降低，影响以后的放射分析结果。有了好的纯抗原，还要采用适当方法加以标记，尽量获取高比放射性、而又能保持良好的特异免疫化学活性的标记物。这些都是放射免疫分析能取得高特异性和高灵敏度的关键问题。

　　多肽激素与蛋白质多用碘标记，最常用的是¹²⁵I。碘化反应的基本过程如下：通过氧化剂的作用，使碘化物（¹²⁵I^-）氧化成的碘分子（¹²⁵I₂），再与多肽激素、蛋白质分子中的酪氨酸残基发生碘化作用。所以不管采用哪一种放射性碘标记法，标记的化合物内部必须有碘原子可结合的基团，即结构上要含有酪胺基或组织胺残基。凡蛋白质、肽类等抗原，在结构上含有上述基团的可直接用放射性碘进行标记。如不含上述基团的，放射性碘无法标记，必须在这些化合物的结构上连接上述基团后才能进行碘标记。

　　因此影响蛋白质、多肽碘化效率的因素，主要决定于蛋白质、多肽分子中酪氨酸残基的数量及它们在分子结构中暴露的程度；此外，碘化物的用量、反应条件（pH、温度、反应时间等）及所用氧化剂的性质等也有影响。

　　常用的标记方法有：

　　（一）氯胺T法

　　氯胺T法标记效率高、重复性好、试剂便宜易得，是目前使用最多的碘标记方法。

　　1．原理氯氨—T（Chloramine--T）是一种温和的氧化剂，在水溶液中产生次氯酸，可使碘阴离子氧化成碘分子。这活性碘可取代肽链上酪氨酸苯环上羟基位的一个或两个氢，使之成为含有放射性碘化酪氨酸的多肽链。

　　2．方法以¹²⁵I—AVP的制备为例。

　　（1）碘化反应：AVP5μg+0.5mol/l PB50μl（pH7.5）+¹²⁵1800μCi,混合后，加入新配置的Ch—t 30μg/15μl(0.05mol/l PB, pH7.5)。迅速振荡混匀，室温下反应40s。

　　（2）终止碘化反应：加入还原剂偏重亚硫酸钠40μg/20μl(0.05mol/l PB, pH7.5),以终止碘化反应。

　　（3）Bio—Gel P₂层析纯化：将碘化反应混合液注入Bio—Gel P₂柱，用0.1n HAC溶液洗脱，分部收集，每2min收集一管，共收集60管。

　　（4）放射性测量：测定各收集管的放射性，出现两个峰，第一峰为¹²⁵I—AVP，第二峰为游离碘盐峰。第一个峰中计算最高的几管，留下备用。

　　为了解标记抗原的质量，每次碘标记后应计算出碘的利用率，标记上多少放射性碘，以及每微克抗原结合上多少放射性碘。

　　（5）标记抗原的贮存：经纯化与检查后的标记物、加入1/8体积的异丙醇，分成若干小份，置于铅罐中，在-20℃以下的冰箱中贮存备用，应避免反复冻融。标记抗原在贮存中是不稳定的，这是因为：一是脱碘，标记的碘从原来位置上脱落，变成游离碘；二是蛋白损伤、变性，成为聚合大分子或断键成小分子碎片。由于上述原因，使B/F明显降低，标准曲线斜率变小，以致不能使用，故需分离纯化，其方法是用Sephadex G100长柱（40～80cm ）过柱，洗脱后出现3个峰。第1个峰分子量大，是蛋白变性的聚合的大分子，尚保留部分抗原决定簇，免疫活性弱；第2个峰是纯抗原的蛋白峰，免疫活性好；第3个峰是游离¹²⁵I或小分子碎片，不具备免疫活性。收集到的第2个纯抗原蛋白峰，免疫活性好；第3个峰是游离¹²⁵I或小分子碎片，不具备免疫活性。收集到的第2个纯抗原蛋白峰，其性能类似于新鲜标记的抗原。分离纯化的方法解决了标记抗原的贮存、长期使用问题，特别对来之不易的抗原更显得重要。

　　2．注意事项

　　（1）放射性碘源的选用：无载体的¹³¹I或¹²⁵I均可用于碘化标记，但应尽量选用新鲜的、比放射强度高的、含还原剂量少的放射性碘源。碘源的比放射强度最好≥50～100mCi/ml，至少也要>30mCi/ml，否则加入碘源的容量要增加，随着带入碘源中含有的还原剂（为放射性碘源运输保存所需加入）量也增加，这将会显著降低碘利用率及标记蛋白比放射强度。放置较久和放射性碘源，一方面因衰变致比放射强度降低，另一方面因水的辐射化学产物增多（主要是¹³¹I源），都会降低标记时的碘利用率。放射性碘源含还原剂（如Na₂S₂O₅等）量多时，会抵消氯胺T的作用，降低碘利用率，甚至导致标记完全失败。放射性碘源要用无载体的，标记所用全部用具和试剂必须不含碘；只要有极少量的碘的污染，非放射性碘就会稀释放射性碘，使放射性碘利用率显著降低。为了便于放射性防护和除污染，以及减少射线对蛋白质分子的损伤，标记投入的放射碘量不宜过大，一般以<5mCi为宜。

　　（2）放射性碘与多肽、蛋白质用量的比例：这比例对标记结果的影响很大。如上述原因，一般标记时放射性投入量不宜过多，示踪实验室中常规每次只用1～2mCi，因而放射性碘与多肽、蛋白质用量的比值主要靠标记时投入的多肽、蛋白质用量来控制。当投入的放射碘量一定时，多肽、蛋白质用量多（即I/多肽、蛋白质比值低），能获得高碘利用率，但所得标记蛋白比放射强度低；相反多肽、蛋白质用量少（即I/多肽、蛋白质比值高），则碘利用率降低，但所得标记多肽、蛋白比放射性随此比值变化都有较大的变动；而当此比值<1后，则碘利用率再下降的幅率较小，标记多肽、蛋白比放射性也不会再增加多少。

　　（3）氯胺T与偏重亚硫酸钠的用量及碘化反应时间：氧化碘化标记法中，会导致失活的最主要原因是氧化还原。氯胺T是氧化剂，早期用氯胺T法作碘化标记时氯胺T用量都比较大，或碘化反应时间较长，结果导致蛋白质结构和活性的严重损伤。氯胺T用量大，或长时间进行碘化反应，结果并不能使碘利用率和标记多肽、蛋白质比放射强度提高多少，反而使标记多肽、蛋白活性下降。当用不含还原剂或还原剂很少的放射性碘源时，试以各种蛋白质（包括白蛋白、球蛋白、ACTH、胰岛素等）作微量标记，当氯胺T用量为20μg/0.1ml反应液、0～20^。C反应20s，碘利用率都已接近或达到最大峰，再加大氯胺T用量和延长反应时间是没有必要的。随放射性碘源中还原剂增多，氯胺T用量也应增加，以达到预期的碘利用率，但决不应盲目加大氯胺T用量和延长碘化反应时间（通常反应时间不要超过1min），否则会导致标记多肽、蛋白质严重失活，不能用于实验。当然，减少氯胺T用量要在了解放射性碘源还原剂含量的基础上，否则碘源中还原剂量较多，双盲目减少氯胺T用量，就会使标记失败。一般用¹²⁵I标记时，氯胺T用量要适当加大。加入氯胺T后必须迅速混匀，以防标记不均匀。氯胺T与偏重亚硫酸钠溶液要新配制的。

　　氯胺T用量减少了，Na₂S₂O₅用量也就可以随之减少。为保证按时终止碘化反应，实验时加入Na₂S₂O₅一般都是过量的。氯胺T用量大时，加入Na₂S₂O₅的剩余量也就会随之增加，这就可能加重某些对还原剂敏感的蛋白质或多肽生物活性的损伤。为此，Na₂S₂O₅用量也不应过多。只要药品没有变质、试剂是新配的，以重量计算Na₂S₂O₅加入量与氯胺T相同就足以保证终止碘化反应（按反应克分子浓度计算，Na₂S₂O₅/氯胺T重量比约0.4），不要盲目加大用量，并应迅速将标记多肽、蛋白质从反应液中分离出来，以尽量减少多肽、蛋白质活性的损伤。

　　某些蛋白质或多肽对氯胺T较敏感，还可进一步减少氯胺T用量、缩短碘化反应时间、降低反应温度，以保护蛋白质的活性。这对一些较容易丧失活性蛋白质或多肽的碘标记十分重要。

　　（4）碘化反应体积：系指加入Na₂S₂O₅终止反应前液体的总量。碘化反应体积愈小，局部反应物浓度愈高，所得碘利用率和标记多肽、蛋白比放射强度就愈高。所以，标记应采用比放射标记效果。当反应液量少（<0.2～0.3ml）时，反应体积对碘利用率和标记多肽、蛋白质比放射强度的高低影响较大；当反应液量大（>0.5～1.0ml）时则影响较小。微量氯胺T法放射碘标记时，一般多控制碘化反应体积<100μl。