（5）碘化反应温度：温度升高，碘化反应速度加快，碘利用率有所增加。但总的来看，反应温度的影响不很大，一般从0^℃到20℃碘利用率相差不过百分之几，故一般在室温下进行标记操作就可能获得重复性好的结果。有些蛋白质或肽类极易丧失活性，则可在0℃进行碘化反应。

　　（6）碘化反应的pH值：受氧化剂氧化生成的活性碘，对多肽链的酪氨酸基苯环羟基邻位的碘化作用，最适pH是7.3～7.8之间。当pH变化时，碘化位置也会发生变化，例如pH值较高时，组氧酸的咪唑环也可被碘化；当pH4～5时，活性碘能迅速氧化色氨酸基生成羟基吲哚，导致肽链断裂。这些都会影响蛋白质或多肽的放射性碘化反应，或引起降解或失活。因此作放射性碘化标记时，除放射性碘源外，所有的试剂都应用适当的缓冲液配制，保证碘化反应在最佳pH条件下进行。

　　（7）微量蛋白质或多肽的吸附损失：界面的吸附损失，在使用大量蛋白质或多肽类时是可以忽略的，但作微量法标记时投入的蛋白质或多肽类只在微克甚至毫克甚至毫微克水平，界面吸附导致的损失就不能忽略。例如制备¹³¹I—ACTH时，所用ACTH浓度低到50Pg/ml时，因表面吸附可损失10%～30%，甚至高达75%。改变pH、加入非特异性载体蛋白、或使用聚苯乙烯、聚乙烯容器时，能减少吸附，但不能完全消除。一般残留在反应管和滴管上的放射性为投入总放射性的2%～8%、残留在层析柱上折占5%～10%。残留量随标记蛋白比放射性强度而直线增减，残留者几乎全部都是标记蛋白。由此可见，微量蛋白质或多肽受吸附而损失的量是不容忽略的。由于微量蛋白质、多肽会被显著吸附而丢失，所以标记时投入蛋白质、多肽量过微（如<2μg）也是不适宜的，否则标记蛋白质、多肽的收回率会太低，并在计算上会造成较大的误差。

　　（8）不同蛋白质、多肽碘化标记的差别：由于不同的蛋白质和多肽分子中含有的酪氨酸数目不同，而且其空间结构也不相同，分子中的酪按酸残基有的容易发生碘化反应，有的就不容易碘化，因此同样条件下进行碘化标记，不同蛋白质或多肽对碘的利用率是不相同的。不同蛋白质经碘化标记后生物活性受损的情况也各不相同。例如ACTH、促性腺激素释放激素（GRH）、促黄体激素释放激素（LRH）等多肽，碘化标记后容易丧失激素活性或与受体结合的活性；而AFP及人绒毛膜促性腺激素（HCG）等的碘化标记，则较容易保存良好的免疫化学活性。

　　尽管不同多肽、蛋白度的碘化标记结果有所差别，但上述讨论的因素对不同多肽、蛋白质碘化标记的影响有共同的规律。掌握了这些因素，就容易成功地获得合格的标记物。

　　不同多肽、蛋白质的分子量大小、理化性质各不相同，放射碘化标记反应后，可根据具体情况采取不同的方法将标记蛋白质（或多肽）与未反应的游离放射性碘及受损伤的标记物分开，常用的方法有凝胶过滤、离子交换层析、吸附层析、各种电泳法等。

　　（二）乳过氧化物酶法（LPO）

　　本法反应温和，对抗原、抗体免疫活性影响小，已被广泛应用。缺点是标记率较低，一般为20～40%。

　　1．原理此法是利用乳过氧化物酶（Lactoperoxidase）有促进微量过氧化氢对¹²⁵I^-的氧化作用，生成¹²⁵I⁺，并标记在多肽、蛋白质酪氨酸分子上。

　　2．方法以标记蛋白质抗原为例。

　　（1）反应液组成：蛋白质2～5μg溶于磷酸缓冲液10～25μl中，加入Na¹²⁵i 1m Ci(10μl)、乳过氧化物酶溶液25ng(10μl)、H₂O₂200ng(10μl)；

　　（2）在室温保温7min；

　　（3）加入H₂O₂200ng(10μl)；

　　（4）过7min再加入H₂O₂(3μl)；

　　（5）保温7min后，加入0.5ml、10mmol/L巯基乙醇以停止反应；

　　（6）10min后加入NaI载体溶液1ml ；

　　（7）按常规方法分离纯化。

　　3．注意事项

　　（1）LPO质量好坏，可直接影响标记率，LPO应在使用前新鲜配制，以防酶活性降低。

　　（2）LPO用量应小于总蛋白质用量的1%，以减少酶自身碘化而带入的放化杂质。

　　（3）碘化反应速率分析表明，酶的催化速度很快。

　　（4）碘化反应在pH4.0～8.5较宽范围内均可进行，最适pH值应依据蛋白质本身性质而定。

　　（5）H₂O₂应保持低浓度，如高于0.1mmol/L，对酶的活性将有抑制作用。

　　（三）Iodogen碘化法

　　此法具有标记率高、反应体积小（3ml水平）、可用低浓度的¹²⁵I原料、对多肽激素和蛋白质的免疫活性损失小、稳定等优点，系常规的碘化方法之一。

　　1．原理　用Iodogen为氧化剂，对蛋白质和多肽抗原进行碘化标记，把¹²⁵I直接引进分子中的酪氨酸残基上。标记过程中被标记样品不与Iodogen混合，标记后取出样品即停止反应，不使用任何还原剂。

　　2．方法

　　（1）标记之前，先把Iodogen溶于有机溶剂，涂于管底，并使之干燥。

　　（2）标记时，将蛋白质溶液10～20μg/10μl(0.5mol/L,pH7.5PB)置于反应管中，反应管置于冰浴中。碘化时，¹²⁵I与蛋白质克分子之比例为1～1.2。反应时间在温和的连续的搅拌下可达10min，从反应管中转移出反应混合液，使其反应停止。反应液转移到含有200μl0.01mol/L、pH7.2PB和0.15mol/L NaCl溶液中，层析分离前再放置5min，使其未标记的碘离子还原成分子碘，以避免在带有缓冲液的柱中使白蛋白碘化。

　　3．注意事项

　　（1）涂有Iodogen的反应管，有氮气中密封，并贮存在-20^℃条件下，至少可用3个月。打开管，使用时间很短。

　　（2）碘化反应时间，7min时标记率达最高，10min时略有减少。PH6.0～8.5时，标记率最高。

　　（3）Iodogen与蛋白质的比率是标记率的函数。最大的标记率是1克分子的Iodogen与8克分子或再多量之比。

　　（四）酰化试剂（Bolton和Hunter试剂）法

　　1．原理这个方法用酰化剂3--（4-羟苯基）丙酸—N琥珀酰胺酯（Bolton—Hunter试剂）做连接试剂，将¹²⁵I标记在羟苯基的2，5位置上，再将琥珀酰胺酯水解，通过一个酰氨键将3--（4—羟基—5—¹²⁵I—苯基）接在蛋白或多肽的末端氨基上。

　　2．方法¹²⁵I—Bolton—Hunter试剂可用氯胺T法自行制备，出已有该试剂的苯溶液作为商品出售。使用时取一定量的标记酯（μmol 蛋白用3～5μmol标记酯），用氮气吹除苯，投入欲标记蛋白5～10μg及缓冲液10～50μl,pH8.0～8.5为宜，在冰浴中反应15～30min后，加入多量氨基酸（如甘氨酸），使过量标记酯消耗掉以终止反应。

　　此法避免了蛋白质与氧化剂的接触，又避免了与放射性碘原子的直接接触，可防止碘源中有害物质对蛋白质的损伤，适用于标记缺乏酪氨酸的蛋白质或酪氨酸在活性中心，引入碘原子后会引起蛋白质的失活。其缺点是标记技术比较复杂，需要接触较多的放射性，经二步反应，碘标记率比较低。一般认为此法不宜标记短肽，而适于分子量大于1万的蛋白质。

　　三、放射性标记化合物的纯化与鉴定

　　（一）纯化标记化合物的常用方法

　　不论使用何种制备方法，要获得合格的标记化合物，都必须将反应物经过仔细的分离、纯化。另外，一些标记化合物，经过一定时间的存放后，往往会出现不纯物，而需再纯化。如碘标记生长激素（¹²⁵--HGH）,在刚标记的第2天，从Sephadex G-100过滤谱上可见，几乎所有的碘化HGH都集中在峰II；保存1个月后，峰II组份减少，峰I和峰III成分明显增加，峰I是集聚的标记生长激素，而峰III是不具有免疫活性的放射性化学杂质（图8--3）。

图8－3　¹²⁵I—HGH的Sephadex G-100过滤谱

实线：新鲜制备的 125I—HGH　虚线：保存1个月的125I—HGH

　　标记化合物的纯化方法，除制备比活度低而化学量又较多的标记物可用重结晶、蒸馏、萃取等常规方法外，一般需用微量分离技术，较方便的是层析法、离子交换法、凝胶过滤及高效液相层析法等。现以碘标记蛋白为例，说明以上各种方法的适用情况。

　　1．凝胶过滤法常用的是Sephadex G系列，也有Biogel—P系列。分离标记蛋白与无机碘时，通常用Sephadex G—25或G—50，然后用G—100进一步纯化。

　　2．离子交换法一般是制成离子交换层析柱，用于分离纯化短肽标记物。

　　3．透析法　能将标记蛋白与小分子化合物很好地分离。

　　4．电泳法可用来分离单碘化、多碘化及已受损伤的蛋白质。

　　5．亲和层析法利用蛋白质与其特异抗体或受体的结合来分离、纯化标记蛋白质。此法特异性强，保持生物活性好，但操作较复杂。

　　6．高效液相层析法此法最大优点是分离效果好、快速，但需特殊设备。

　　7．伴刀豆球蛋白A（ConA）吸附法ConA是一种植物凝集素，对糖蛋白有良好吸附能力，因此适于分离标记糖蛋白。吸附的标记糖蛋白可用含0.2mol/L甲基α-吡喃葡萄糖苷的PBS洗脱。

　　（二）标记化合物的主要质量指标

　　作为示踪剂及分析试剂的标记化合物，应具有比一般非标记化合物更高的质量要求。标记化合物的质量指标包括：放射性核纯度、放射化学纯度、放射性比活度、生物活性和免疫活性以及标记位置和定量分布情况等。

　　1．放射性核纯度及其检查方法

　　（1）放射性核纯芳可用下式表示：

　　放射性核纯度（%）=所需放射性核素的活度/样品的总放射性活度×100

　　（2）放射性核纯度的检查方法：每一种核素都有它的特征，即物理半衰期及射线能量，故可通过半衰期及射线能量的测定来鉴别所需放射性核的纯度。

　　①测定半衰期法：如短半衰期放射性核素，一般可采用时间跟踪法，每隔一定时间测量放射性一次，共测3～5个半衰期，以每次测得的放射性计数为纵座标，时间为横座标，在半对数纸上作图，并通过分析，可求出该放射性核素的纯度。

　　②测定射线能量法：利用每一放射性核素的特征射线谱来检查放射性核纯度。γ发射体可用γ能谱仪，如检测⁵⁷Co和⁵⁸Co的核纯度：纯β-发射体可用液闪仪，调节　道宽及淬火校正后，对如³H、¹⁴C、³²P的核纯度进行测量；而β、γ混杂垓素，则用吸收法测量，如^99mrTc中母体杂质^99mMo的含量测量，是通过适当厚度的铅屏蔽，将^99mTc 发射的能量为141ke V的γ射线减弱后，测定⁹⁹Mo发射的能量为739Kev 的γ射线。

　　2．放射化学纯度及放化纯度鉴定

　　（1）放射化学纯度：放射性核素标记化合物都是以一定的化学形态存在的，所以：

　　放射化学纯度（%）特定化学形态的放射性活度/样品总放射性活度×100