二、集落刺激因子（CSF)

　　骨髓造血干细胞体外半固体培养技术的建立和重组集落刺激因子（colony-stimulating factor,CSF)的问世给集落刺激因子的研究提供了前提。根据细胞因子刺激不同造血细胞系或不同分化阶段的细胞在半固体培养基中形成不同细胞集落，分别命名为粒细胞CSF（G-CSF）、巨噬细胞CSF（M-CSF）、粒细胞和巨噬细胞CSF（GM-CSF）、多重集落刺激因子（multi-CSF,又称IL-3）、干细胞因子（SCF）、红细胞生成素（EPO）。有人将IL-5称为嗜酸性粒细胞集落刺激因子（Eo-CSF)。此外，IL-1、IL-6和IL-11在骨髓多能干细胞早期的分化中也有重要的作用。

　　（一）IL-3

　　1981年Ihle等发现ConA刺激小鼠脾细胞的培养上清中含有一种因子，能提高裸鼠脾脏淋巴细胞成熟淋巴细胞标志20-α-羟固醇脱氢酸（20-α-hydroxysteriod dehydrogenase,20αSDH）的阳性率，命名为白细胞介素3（interleukin-3,IL-3)。由于IL-3可刺激多能干细胞和多种祖细胞的增殖与分化，又称为多重集落刺激因子（multi-colony stimulating　factor,multi-CSF)。

　　1.IL-3的产生　主要由活化T细胞或T细胞克隆产生。小鼠髓样单核细系（myelomonocytic cell line) WEHI-3B细胞系可自发产生一定水平的IL-3。此外，胸腺上皮细胞、活化小鼠肥大细胞等也可表达IL-3。

　　2.IL-3的分子结构和基因　1984年美国和澳大利亚分别从ConA刺激小鼠T细胞和WEHI-3B细胞中提取高活性部分mRNA，逆转录成cDNA，进行克隆化和DNA序列分析。编码小鼠IL-3和GM-CSF的基因都定位于第11号染色体。IL-3的基因组由5个外显子和4个内含子组成。cDNA编码166氨基酸残基，N端26氨基酸残基为信号肽，此外N端另有数个氨基酸残基可能被血清蛋白酶所切除。成熟小鼠IL-3由131氨基酸残基组成，含有糖基，分子量为25～28kDa。

　　1986年美籍华人杨育中从长臂猿T白血病细胞株MLA144中提取IL-3mRNA，成功地获得长臂猿IL-3cDNA(gIL-3cDNA),后又用gIL-3cDNA作为探针筛选人IL-3基因组DNA，并克隆成功。人IL-3基因结构与小鼠相似，由5个显子和4个内含子组成，人与鼠IL-3DNA约有45%同源性，氨基酸有29%同源性，但人鼠间IL-3生物学作用无交叉反应。人和长臂猿IL-3有高度同源性，成熟的IL-3分子都由133个氨基酸残基组成，仅11个氨基酸残基不同，在第16位和84位上2个半胱氨酸残基在分子内形成二硫键，此外还有2个N糖基化点 。在体外糖基不影响IL-3的生物学活性。hIL-3启动子上游调控区含有多个转录调控子同源位点，其中AP-1（TGAGTCA）位于-301处，CREB（TTACGTCT）位于-147处，NFAT-1（GATGAATAAT）位于-156处，CK-1（GAAGGTTCCA）位于-126处，CK-2（TCAGATAA）位于-115处。hIL-3转录调控主要受上游两个顺式调控区的调控。第一个位于-121到-161之间，它对于hIL-3转录激活最为重要，其间除含有CREB、NFAT-1外，新发现了对hIL-3表达起决定作用的转录调控蛋白结合位点，该位点被命名为NF-IL-3-A（ATGAATAA）。第二个调控区位于-301处的AP-1位点，AP-1位点能强有力地增强hIL-3基因的转录。此外，最近还发现了hIL-3转录抑制调控区，位于-250和-271之间，称为NIP位点。目前认为位于其上游-301处AP-1对hIL-3的转录增强作用是通过消除NIP对hIL-3基因转录的抑制来实现的。

　　人IL-3以及IL-4、IL-5、IL-13、GM-CSF、M-CSF、M-CSF受体（c-fms编码产物）、PDGFR（血小板衍生的生长因子受体）、β₂-肾上腺素能受体（β₂AR）、内皮细胞生长因子（ECGF）和CD14的基因都定位于第5号染色体。这种在一定区域内连锁的现象可能与协同调节造血过程有关，并可能与骨髓发育异常综合征（myelodysplastic syndrome,MDS)、原发性急性非淋巴细胞白血病（acute nonlymphocytic leukemia,ANLL)、顽固性巨幼红细胞贫血等疾病的发病有关。

　　3.IL-3受体　分子量为140kDa，属于红细胞生成素受体超家族成员，而且具有2个该家族的结构域，IL-3R胞浆区是酪氨酸激酶的底物。有关IL-3Rβ链参见本节GM-CSF受体和本章第三节。

　　4.IL-3的生物学活性　IL-3与其它集落刺激因子的生物学作用见表4-4。除具有多重集落刺激作用外，最近发现IL-3可刺激皮肤上皮细胞、CD4-CD8-TCRαβ细胞、肥大细胞、嗜碱性粒细胞的增殖，阻止肥大细胞发生程序性细胞死亡。

　　（二）GM-CSF

　　1977年Burgess等从小鼠肺条件培养液中发现一种能刺激粒细胞和巨噬细胞形成集落的因子，命名为粒细胞-巨噬细胞集落刺激因子（granulocyte-macrophage colony stimulating factor,GM-CSF)。1984年和1985年小鼠和人GM-CSF的cDNA分别克隆成功。

　　1.GM-CSF的产生　T细胞、B细胞、巨噬细胞、肥大细胞、内皮细胞、成纤维细胞等均可产生GM-CSF。其中T细胞和巨噬细胞一般在免疫应答或炎症介质刺激过程中直接产生；而内皮细胞、成纤维细胞可能通过IL-1和TNF的诱导而产生。

表4-4　CSF的生物学功能及临床应用　 

CSF 分子量（kDa)
鼠　人 主要产生细 胞 主要集落刺激作用 促进吞噬细胞功能 临床治疗疾病 使用情况 基因定位 外显子/内含子 人与鼠同源性（%） 人与鼠活性交叉 糖基化 G-CSF（CSF-β） 25　30 Mo,En,Fb 髓样、中性粒细胞集落增殖、分化成熟 PMN的吞噬和杀伤功能，ADCC 增加化疗作用，艾滋病，白血病，再生障碍性贫血、癌症，骨髓移植 FDA已批准 17q11～q13 5/4 73 + 0- M-CSF
（CSF-1） 70　45（同源二聚体） Mo、En、Fb 前单核、单核 M吞噬和细胞毒功能，ADCC，促进IL-1、TNF-α的产生 Ⅰ期临床试验 5q23～q31 80 + N- GM-CSF（CSF-α，CSF-2） 23　22 Tact、Fb、En、Mo 多能干细胞、髓样干细胞、单核、嗜酸、中性粒细胞增殖 增加M、Mo、PMN、Eo的数量，提高吞噬功能 二次化疗所致中性粒细胞减少症，异体和自体骨髓移植，再生障碍性贫血，烫伤骨髓功能衰竭，血小板减小 FDA已批准 5q23～q31 4/3 54 - N- IL-3（multi-CSF) 25　18 Tact 多能干细胞、多种定向祖细胞、前髓、髓样、红样、巨核、前单、单核、中性、嗜酸、肥大细胞 体内注射IL-3增加外周血中PMN、Mo、Eo的数量，促进Eo ADCC Ⅰ、Ⅱ期临床试验 5q23～q31 5/4 29 _ N- EPO 30　30-34 肾基质细胞 红细胞系 促进BFU-E、CFU-E以及红系的增殖和分化 贫血 FDA已批准 7q11～q22 5/4 80 + N-/0- SCF 31×2

（同源二聚体） 肝细胞 干细胞、造血祖细胞、髓系、红系、巨核细胞系 干细胞增殖和分化，与IL-3、G-CSF、GM-CSF和EPO有协同作用 癌症 Ⅰ期临床试验 　 　 80 　 　

　　Mo:单核细胞；M：巨噬细胞；Eo：嗜酸性粒细胞；En：内皮细胞；Fb：成纤维细胞；Tact:活化T细胞

表4-5　产生GM-CSF的细胞和刺激物

　　注：PTH：甲状旁腺激素

　　2.GM-CSF的分子结构和基因　人和鼠GM-CSF基因DNA序列有高度同源性，基因组约2.5kb长，包括4个外显子和3个内含子。小鼠GM-CSF基因位于11号染色体。在人则位于第5号染色体长臂，在IL-3基因下游9kb处，此外，人的IL-4、IL-5、M-CSF、M-CSF受体（C-fms)和早期生长应答基因-1（early growth response gene-1,EGR-1)也位于第5号染色体的长臂（表4-6）。

表4-6　人第5号染色体上某些生长因子、受体和CD抗原的基因

　　人和小鼠GM-CSF基因以及其它某些淋巴因子基因上游区TATA盒上游330bp有较高的同源性，包括一个富含GC的区域和一个10个核苷酸同一的序列（decanucleotide consensus sequence)，这一序列也见于人或小鼠IL-2和IL-3基因的promoter中。此外，CK-1（cytokine consensus-1)或称保守的淋巴因子元件1（conserved lymphokine element 1,CLE-1)在小鼠或人G-CSF、GM-CSF、IL-2和IL-3的基因组中均可见到；而CK-2仅见于人或小鼠GM-CSF和IL-3的基因组中。

　　人和小鼠GM-CSF分别由144和141氨基酸残基组成，均包含17氨基酸的先导序列。成熟的人和小鼠GM-CSF分子分别由127和124个氨基酸残基组成，在氨基酸水平上有54%同源性，但生物学作用具有种属特异性。GM-CSF含有高度保守结构的2个链内二硫键，其中51个与93位之间形成的二硫键对该因子的生物学活性有重要作用。人GM-CSF分子中第21～31和78～94氨基酸残基对刺激造血功能极为重要，而糖基无论在体内或体外对GM-CSF的生物效应似乎无影响。

　　用GM-CSF转基因小鼠造血细胞为研究模型，发现这类小鼠有高水平的GM-CSF，同时伴有许多细胞组织的损伤。自分泌GM-CSF的造血细胞同时转录IL-1α、TNF和FGF（成纤维细胞生长因子）mRNA。

　　13.GM-CSF的生物学活性　GM-CSF有多种生物学活性（表4-4和4-7）。

表4-7　GM-CSF的生物学活性

　　有报导GM-CSF和IL-3的融合蛋白可明显增强造血功能，如融合蛋白PIXY321与同时表达GM-CSFR和IL-3R细胞株结合，亲和力增加5～10倍，促进细胞增殖作用是GM-CSF加IL-3作用的10倍，刺激BFU-E、CFU-E、CFU-GM、CFU-GEMM造血细胞集落作用比单独使用IL-3、GM-CSF或两者联合应用要高10～20倍。