第二节　免疫球蛋白基因的结构和多样性

表3-2　免疫球蛋白基因定位

（人） 基因定位（染色体） 人 小鼠

κ轻链 IGK 2p11 6

λ轻链 IGL 22q11 16

H重链 IGH 14q32.3 12

　　免疫球蛋白（Ig）的分子由IGK、IGL和IGH基因编码。IGK、IGL和IGH基因定位于不同的染色体（表3-2）。编码一条Ig多肽链的基因是由胚系中数个分隔开的DNA片段（基因片段）经重排而形成。1965年Dreyer和Bennet首先提出假说，认为Ig的V区和C区由分隔存在的基因所编码，在淋巴细胞发育过程中这两个基因发生易位而重排在一起。1976年Hozumi和Tonegawa应用DNA重组技术证实了这一假说。

　　一、 Ig重链基因的结构和重排

　　Ig重链基因是由V、D、J和C四种不同基因片段所组成。

　　（一）Ig重链可变区（V区）基因

　　重链可变区基因是由V、D、J三种基因片段经重排后所形成。

　　1.重链V区基因的组成　编码重链V区基因长约1000～2000kb，包括V、D、J三组基因片段。

　　（1）重链V基因片段：小鼠V_H基因片段数目为250～1000个。根据V_H基因片段核酸序列的相似性（>80%同源性），至少可分为11个家族（family).人V基因片段约为100个，至少可分为6个家族，每个家族含有2～60个成员不等。V基因片段由2个编码区（coding regions)组成：第一个编码区编码大部分信号序列；第二个编码区编码信号序列羧基端侧的4个氨基酸残基和可变区约98个氨基酸残基，包括互补决定区1和2（complementarity determining region 1和2，CDR1和CDR2）。

　　（2）重链D基因片段：D（diversity)是指多样性。D_H基因片段仅存在于重链基因中而不存在于轻链基因。D基因片段编码重链V区大部分CDR3。小鼠D_H共有12个片段，位于V_H和J_H基因片段之间，大部分D_H片段较为集中，约占60～80kb，但靠上游的D_H可能位于V_H区域内，最后一个D_H片段与J_H基因5'端相距约0.7kb。人类D_H片段可能有10～20个左右。

　　（3）重链的J基因片段：J（joining)指连接，是连接V和C基因片段。J_H编码约15～17个氨基酸残基，包括重链V区CDR3除D_H编码外的其余部分和第4骨架区。小鼠J_H基因片段有4个，与Cμ相距约6.5kb。人有9个J_H，其中6个是有功能的J_H基因片段。

　　V、D、J基因片段经重组连接在一起，组成2个外显子，一个外显子编码信号序列的大部分，另一个外显子编码信号序列的其余部分和重链可变区。

　　小鼠和人在胚系中Ig基因的结构见图3-4和图3-5。

　　2.重链可变区基因的移位　在重链基因重排开始时，二条染色体上都发生D基因片段移位到J基因片段而发生D-J基因连接。在此以后，只有其中一条染色体上的V基因片段与D-J基因片段连接。V_H基因片段5'端含有启动子（promoter)，J_H和C_μ基因片段之间的内含子中含有转录增强子（transcriptinal enhancer)。如果一条染色体V_H基因与D-J基因重排无效（non-productive），另一条染色体的V_H基因片段开始发生移位，与D-J基因片段连接。

　　某些与Ig基因片段重排有关的特殊序列称为识别序列（recognition sequences)，位于V基因片段的3'端与J基因片段的5'端之间以及D基因片段的两侧。V基因片段3'端、J基因片段5'端以及D基因片段的两侧也是DNA重排识别信号所在区域，这些识别信号包括三部分：（1）高度保守的回文结构的七聚体（palindromic heptamer);(2)较少保守、富含A/T的九聚体(nonamer);（3）七聚体和九聚体之间不保守的间隔序列（spacer sequence)，含有12±1碱基对或23±1碱基对。根据12/23碱基对间隔规则（或称1圈/2圈定律），两个基因片段的重组仅发生在两个基因片段之间：各有一个12个碱基对片段和一个23个碱基对片段的结构（图3-6）。

图3-4 小鼠Ig基因结构

　　注：（1）L：先导序列基因片段　　V：可变区基因片段　　D：D基因片段
　　J：J基因片段 　　　　　　C：恒定区基因片段　　E：转录增强子
　　　　　S：转换区　　　　　　　　*：假基因
　　　（2）内含子区域所标数字表示DNA长度（kb)。
　　　（3）每个C_H基因用一个方框表示，实际上包括几个外显子，如C_μ含有6个外显子。
　　　（4）λ基因增强子位于Cλ4和Cλ1基因片段的下游。

图3-5 人Ig基因结构

　　注：（1）L：先导序列基因片段　V：可变区基因片段　D：D基因片段
　　J：J基因片段 　　　　C：恒定区基因片　*：假基因
　　（2）内含子区域所标数字表示DNA长度（kb)
　　（3）每个C_H基因用一个方框表示，实际上包括几个外显子

　　参与V/（D）/J基因重组过程的酶称为V/（D）/J重组酶（recombinase),有关于执行识别、切割和重新连接基因片段重组酶的纯化和鉴定工作还刚开始。重组酶实际上包括重组过程中多种酶的活性。最近在前B细胞（pre-b cell)中已经鉴定出两种刺激Ig基因重排的基因，称为重组激活基因1（recombination activating gene 1,RAG-1）和重组激活基因2（RAG-2），其确切的作用机理还不太清楚。重组酶作用的特点是：（1）淋巴细胞特异性的，非淋巴样细胞如成纤维细胞无重组酶活性，这可能解释了Ig基因的重排仅见于B淋巴细胞。目前一般认为T细胞TCR基因重排中的重组酶与B细胞中重组酶相同或相似。（2）重组酶发挥其功能仅限于B细胞发育早期，未成熟B细胞如前B细胞（pre-b cell)细胞系重组酶活性很高，但抗体生成细胞或骨髓瘤细胞无明显重组酶活性，因此时B细胞已经分泌某一特异性抗体，不再发生重排其它的Ig基因，因此也不会改变原先所产生抗体的特异性。转换重组酶（switch recom-binase)可能与VDJ重组酶（VDJ recombinase)相似，但缺乏七聚体/九聚体（heptamer/nonamer）识别蛋白。重组酶功能异常可导致机体不能产生Ig和TCR，很可能与重症联合免疫缺陷(severe combined immunodeficiency,SCID)的发生有关。例如SCID小鼠16号染色体着丝点末端存在一个scid基因，为单基因常染色体遗传基因。scid基因纯合将影响DNA重组酶的识别功能，在TCR或BCR基因片段重排时不能识别正确的位点，使T细胞、B细胞在淋巴干细胞发育早期即夭折，导致重症联合免疫缺陷。

图3-6　参与Ig基因重排组酶识别的DNA序列

　　（二）Ig重链恒定区（C区）基因

　　1.重链C基因片段　重链恒定区基因由多个外显子组成，位于J基因片段的下游，至少相隔1.3kb。每1个外显子编码1个结构域（domain)，铰链区（hinge region)是由单独的外显子所编码，但α重链的铰链区是由C_H2外显子的5'端所编码。大多分泌的Ig重链羧基端片段或称尾端“tail piece”是由最后一个C_H外显子的3'端所编码，而δ链的“tail piece”是由一个单独的外显子所编码。小鼠C_H基因约占2000kb，其外显子从5'端到3'排列的顺序是Cμ-Cδ-Cγ3-Cγ1-Cγ2b-Cγ2a-Cε-Cα。人C_H基因外显子排列的顺序是Cμ-Cδ-Cγ3-Cγ1-Cε2（pseudo基因）Cα1-Cγ2-Cγ4-Cε1-Cα2。其中基因片段Cγ3-Cγ1-Cε2-Cα1和基因片段Cγ2-Cγ4-Cε1-Cα2可能是一个片段经过一次复制而得，为研究C_H基因的起源和进化提供有用的依据。

　　2.免疫球蛋白类型转换　1964年Nossal等发现B淋巴细胞存在着类型的转换。Ig类型转换（class switch)或称同种型转换（isotype switch)是指一个B淋巴细胞克隆在分化过程中V_H基因片段保持不变，而发生C_H基因节段的重排、比较C_H基因片段重排后基因编码的产物，V区相同而C区不同，即识别抗原特异性不变，而类或亚类发生改变。这种类型转换在无明显诱因下可自发产生。

　　局部微环境和细胞因子可影响和调节免疫球蛋白类型的转换，如在肠道派伊尔氏结的B细胞V基因片段优先转换到Cα1进行重排，因此主要合成和分泌IgA。在体外向经LPS刺激的小鼠B细胞中加入IL-4，可促进B细胞产生IgG1和IgE，抑制IgG2b产生；低浓度的IL-4主要诱导产生IgG1，高浓度IL-4主要诱导产生IgE。面IFN-γ则诱导小鼠B细胞合成IgG2a，抑制IgE的产生。TGF-β、IL-5和IL-6对IgA的产生具有促进作用（表3-3）。细胞因子调节B细胞Ig类别转换的机理可能是：（1）刺激某些细胞的克隆选择性的增殖，使分泌某特定类、亚类抗体的克隆细胞增加，如IL-5、IL-6促进IgA。产生除通过同种型转换进行调节外，还可选择性促进IgA定向细胞分化增殖为IgA分泌细胞。（2）通过诱导特定位置上两个转换区的重组，诱导B细胞由分泌IgM向某一同种型Ig转换。如高浓度IL-4促进LPS诱导小鼠B细胞产生IgE，主要是使Cε转换区与重组酶的接近（accessibility),通过同种型转换促进IgE的产生。

表3-3　细胞因子对LPS诱导的Ig类和
亚类转换的调节作用（占总Ig%）

　　注：（1）纯化的小鼠IgM+IgD+B细胞体外培养时，加入不同的细胞因子和LPS，然后检　　　　　　　LPS，然后检测不同类或亚类免疫球蛋白的百分比。
　　（2）由于未检测所有类和亚类Ig，所以每组Ig总百分比不到或接近100%。

　　Ig类型转换可能通过以下两种机理。

　　 （1）缺失模型（deletion model):又称linear orderly deletiom of H chain genes。以小鼠C_H基因为例，如Cμ和Cδ基因片段被缺失，那么先前重排的VDJ就会按照顺序与下一个C_H基因即Cγ3发生重排，经转录和翻译后，编码γ3重链；如缺失所有的γ链亚类基因，依次会产生ε链。上述模型在被刺激后小鼠B细胞在体外培养中产生Ig类别的顺序得到证实，即先产生IgM，然后依次产生IgG3和IgG1等。但这个模型不能解释免疫动物或抗原刺激B细胞培养中单个B细胞可同时表达几种不同类或亚类的重链。

　　（2）RNA的不同剪接：除DNA水平的Ig类型转换形成外，RNA水平的不同剪接（alternative RNA splicing）也可产生不同的Ig类型。 Cμ和Cδ基因片段之间无S区，IgM和IgD共表达的B细胞系DNA分析表明，Cμ和Cδ基因片段没有发生重排，相同的V_H出现在μ或δ链的mRNA上，表明它们可能有一个共同的mRNA前体，通过不同的或差异剪接（differential splicing)分别形成μ链和δ链mRNA。初级RNA转录本（primary RNa transcript)是由VDJ复合体连接Cμ和Cδ基因片段经转录后形成。如果在剪接过程中切除初级RNA转录本中的Cδ部分，经加工后形成μmRNA；如去除初级RNA转录本中的Cμ部分，则加工后形成δmRNA。这两种mRNA分别被翻译，使单个B细胞同时产生μ和δ链，同时表达IgM和IgD。同样的机理可从一条长的primary RNA转录本中加工为 μmRNA和εmRNA（或其它重链mRNA），同时表达IgM、IgE或其它类Ig。