第四节　测定酶活性浓度的两大类方法

　　一、固定时间法（取样法）

　　前面已经提到，早期临床实验室测酶活性时常使用比色法，先让酶与底物在一定温度下作用一段固定的时间，然后停止酶反应，加入试剂进行化学反应呈色测出底物和产物的变化。由于比色法灵敏度较低，或由于手工操作不易控制好，常定在30分钟左右。历史上这类方法常被命名为“终点法”、“二点法”、“固定时间法”和“取样法”。大多数文献使用“固定时间法”。此命名指出了用这类方法测酶活性浓度，必须保证酶和底物在所选定的温度下作用时间要很精确，否则将引起较大误差。但“取样法”的命名更具有特征性。因它指出此类方法和下面将提到的另一类连续监测法相比较，最基本一点的是此类方法停止反应后才测底物或物的变化。很难进行连续监测，而另一类方法则不需停止酶反应，就可测定反应物的变化，很容易观察到反应的整个过程。后一类方法开始于50年代，Warburg首先用分光光度计。在340nm处直接监测到反应物NADH的动态变化过程。由于不停止酶反应，不需添加其它呈色试剂。测定方法简单，结果准确，逐步取代了“取样法”成为目前测酶活性的主要方法。

　　由于经历了一个发展过程，命名比较混乱而且大部分不甚确切，IFCC建议命名为“连续监测法”，不用目前广为流行的“动态法”术语。其原因是目前测酶活性浓度方法都是基于化学反应。图17-6是一个典型的化学反应过程。

图17-6　动态和平衡概念的示意图

　　可以看出整个反应过程，可以大致分为二个时期。一开始为动态期，化学反应按一定速度进行，反应物浓度随时间而变化，且变化程度不断变小，到一定时间。化学反应或者达到平衡，或者反应达到终点，此时反应速度为零，反应物浓度不变。最近IFCC文件按所用方法所测定的反应是在达到平衡前还是平衡后。分别命名为动态法或平衡法。一般文献往往将后一类方法称为终点法。

　　二、连续监测法与反应进程的分析

　　从这个权威性的方法分类来看，前面所提到的二类测酶活性浓度方法都应归纳为动态法。目前广为流行的“动态法”命名显然是不确切的或者是不合适的。应该更多采用IFCC文件中建议的“连续监测法”命名。

　　从酶反应曲线来比较此二类方法。图17-7是一个典型酶反应过程。

图17-7　酶促反应中基质[S]、产物[P]
和反应速率V在不同时间变化的模式图

　　在酶作用下，底物[S]浓度不断下降，随之有相应产物[P]产生。不少酶在反应一开始的阶段，由于各种因素影响，反应速度较慢，称为延滞期，随后在过量浓度的底物存在条件下，酶反应以恒定的速度进行，不受底物浓度变化的影响，这段反应称为线性反应期或零级反应期。随时间延长，反应速度除与酶量有关，还与底物浓度有关。即v＝k(a－x)，式中a为原来底物浓度，x为消耗的底物浓度，如反应物浓度项上指数为1，称为一级反应，假如反应速率受二种或二种以上物质浓度的影响，则各个反应物浓度项上指数总和作为反应级数，可以分别为一级、二级或多级反应，总的将这段反应时期称为非线性反应期。

　　很明显如测反应速度的目的是为了从此推算出酶含量的多少，则只有测线性反应期的反应速度才能作到此点。在延滞期、非线性期测的结果不准确，一般是偏低的。

　　取样法由于方法学上的限制，一般只测二管：一为没发生酶反应的对照管，另一管测酶作用一段时间后反应物的变化，实际上测得是平均速度，而且二管间隔时间都较长，在半小时左右，图17-8中t₀，t分别代表不同时间二管反应物的量，虽然从t到t₀反应物变化量是相同的。但实际反应过程是多种多样的。

　　只有当反应如曲线A时，用“固定时间法”才能测出真实的酶活性，实际工作中是很少见的，图中曲线B代表了最常见的反应情况，在一个很短的线性反应期后在大部分测定期间内主要为非线性反应期。曲线C说明在测定期间包括了延滞期，曲线D则不仅包括了延滞期，还包括非线性期，在这些反应中如用固定时间法来测定，结果是不够准确的，一般是偏低的，而且酶浓度愈高，偏离程度愈大。

　　假如从上节叙述中得出一个重要结论：即在设计和选择测定酶活性浓度方法时必须是在“最适条件”下测定最大反应速度。那么从这段叙述中可得出一个对上述结论一个很重要的补充，即所测的最大反应速度还应该是初速度即V₀。

　　理论上的V₀在实际工作中是不存在的，必须让酶和底物作用一段时间，消耗掉一定量的底物，才能测出反应速度，一般说，如消耗底物在5％内所测到的反应速度都可认为是初速度，如底物浓度很高时，底物消耗在20％以内的反应往往还在线性反应期。

　　连续监测法能满足上述重要要求。由于不需停止酶反应。很容易得到整个酶反应曲线，然后根据反应曲线情况，避开延滞期和非线性反应期，只在线性反应期测定最大反应初速度。同时由于分光光度法的高灵敏度，自动生化分析仪的高精密度，连续监测法能在很短时间，甚至在1分钟反应时间，准确测定反应速度，从而求出准确的酶活性浓度。“固定时间法”测定时间长达30分钟，很难满足上述方法学上测定初速度V₀的要求。

图17-8　二点测定法中可能引起的误差

　　从理论上说，只有当测定的是初速度，米氏方程式才能成立，并可能测出真正的Km。用“固定时间法”测出的速度受到逆反应速度的影响。可以下式表示有逆向反应存在时的酶反应过程。

　　k1　k₂　k₃

　　E＋S→ES→EP→E＋P

　　←　←　←

　　K_－1　k_－2　k_－3

　　存在着EP和P时，就会出现逆反应，此时所测的为一表观速度（Va）或反应的净速度。

　　Va＝k₂[ES]－k_－2[EP]

　　[E]t代表酶总量，在反应过程中包含了游离酶[E]、酶底物复合物[ES]和酶产物复合物[]EP]。

　　Ks为[ES]的解离常数，Kp为[EP]的解离常数，故：

　　代入上式得：

　　根据Maldanc公式Keq＝VfKp/VrKs得：

　　在反应特定时间，产物[P]为一定值，上式得：

　　此公式从理论上说明，如所测反应有逆反应存在时，不存在原来的米-门方程式。用各种作图法很难求出准确的米氏常数。如果说所测酶反应不仅存在着逆反应，产物还抑制了酶反应，则动力学公式将更为复杂。这就是为什么不仅在建立方法时，就是在研究酶的动力学时，也总是希望所测量的都是酶反应的初速度。

　　以上这二类方法并不是概括了所有测酶活性浓度的方法，也并不排除在非线性反应期测酶活性浓度的可能性。如固定底物变化量，则不同标本达到此变化终点的时间，与酶量成反比例，Somogyi曾提出一种测淀粉酶的方法，酶与底物混合后。每隔半分钟取一滴出来加入碘液呈色，观察颜色由紫色变为红色时间，也就是淀粉酶全部水介变为糊精的时间，并由此时间的长短计算出酶含量高低，这类方法不需使用很高浓度的底物，有其独特之外，在自动生化分析仪中也曾使用类似的方法，值得人们重视。

　　三、连续监测法测酶活性浓度

　　连续监测法具有众多的优点，随着科学技术的发展，自动生化仪的使用，正在逐步取代“固定时间法”，发达国家从50年代到70年代末用了约20余年的时间，我国从80年代初开始使用连续监测法，虽然发展很快，但至少仍有不少地区医院实验室仍使用老的方法，就是已使用新法的实验室，也不一定掌握得很好，本节将比较详细地从分类，酶偶联反应，测定注意事项等方面对连续监测法加以介绍。

　　（一）连续监测法种类

　　⒈直接连续监测法这类方法是使用各种分析手段，如分光光度法、荧光法、pH计、旋光计、电导仪等等，在不停止酶反应条件下直接测反应体系中底物或产物的变化，从而计算出酶活性浓度，其中尤以分光光度法应用最多，应用最广的有NAD(P)H反应系统，可以测定大部分的脱氢酶，还有的是所谓“色素原”底物，其本身为无色或微黄色，在酶作用下生成有色化合物，适用于测定水解酶和一些转移酶。

　　⒉间接连续监测法直接法试剂简单，操作方便，可惜的是只有当底物与产物之间，在光学性质或其它理化性质有显著差异时，才有可能使用此法。到目前为止，大部分酶都无法用直接法测定。

　　科学家还曾设法在原来反应体系中添加一些试剂，这些试剂必须不与酶作用也不影响酶活性，同时又能与酶反应物迅速作用，产生可以被直接测定的物质，典型的例子是Ellman的胆碱酯酶测定法，底物为硫代乙酰胆碱，酶水解产物硫代胆碱与添加的二硫代硝基苯甲酸（DTNB）作用立刻生成黄色化合物，可在412nm用分光光度法连续监测。

　　实际工作中，更多的是在反应体系中加入另一酶试剂。进行适当的酶促反应，完全可以胜任上述工作。目前酶偶联法已经成为应用最广、最频繁测酶活性浓度的方法。

　　最简单的酶偶联反应为以下模式：

　　Ex为所要测定的酶，A、B二物质分别为其底物和产物，对此二物质变化，无法直接监测，此时可加入其它酶，其底物为Ex的产物B，其反应产物C可直接监测，这样通过第二个酶反应有可能推测出第一个酶的活性浓度，外加的第二个酶称之为指示酶Ei。

　　如果一些酶反应找不到合适的指示酶与其直接偶联，此时往往可以加入另一种酶，将二者连接起来，模式如下：

　　将这种联接的酶称之为辅助酶（Ea）。个别情况可能使用二种乃至二种以上的辅助酶。

　　酶偶联反应与一般酶反应的一个重要区别处在于其有一个明显的延滞期。酶偶联反应一开始只存在着底物A，不存在指示酶的反应，随着产物B的出现和增加，指示酶反应随之加快，Ex和Ei反应速度相等，也就是达到稳态。从酶反应开始至稳态期间，指示酶反应较慢且不稳定，称为延滞期。显然这期间指示酶反应速度不能代表测定酶量多少。设计或选择酶测定方法时，如果用酶偶联法，延滞期越短越好，测定时间一定要避开此期。

　　是不是所有类型的酶偶联反应都可用来测酶活性浓度？回答是否定的。因为测酶的活性浓度是依据测定酶反应速度——△A/△t或△B/△t求出。在酶偶联法，此值无法直接求出，而是通过测定指示酶反应△C/△t间接求出，要使酶偶联法测得的酶活性浓度准确可靠，则Vind＝Vx。换言之，指示酶的最大反应速度必须等于或接近测定酶的最大反应速度。