（三）常数K值的检验

　　摩尔吸光系数（ε）对一定物质而言常是一个定值，但在一些外界条件影响下也会有所变化。最明显例子是对硝基酚，随pH不同，颜色差异明显，当pH＞10时，405nm处其ε为18500，在pH7.0，ε下降为9400，颜色下降几乎一半。温度变化时，也会对NAD(P)H的ε产生一些影响。当波长大于334nm时，随温度升高，同一波长的ε值会轻度下降。

　　同时ε值是指用分光光度法，也就是在近似单色光的光源条件下才能成立，实际上大多数自动分析仪使用的是干涉滤片，波峰值可能出现差异，个别的半波宽可能为10nm乃至更大。由于杂散光的存在，会明显改变ε值，假如再考虑到注加系统的误差，实测K值很可能与理论K值不一致。Onuki检测了三台Hitachi-7150型自动分析仪测AST的K值分别为－5466、－5421、－5559。而理论K值为－6111则结果约增加为1.12倍。

　　测定实际的K值不是一件困难的事，目前有些自动分析仪已有相应的软件和试剂可以进行检测。事实上对一些性质稳定的物质如对硝基酚、对硝基苯胺，可以用高纯试剂配成标准品或直接购买可靠的校准品，将它们作为标本进行酶的测定，根据已知标准品的浓度和吸光度变化就可计算出实际K值，但此法不适用于测与NAD(P)H反应有关酶测定的K值。因为NAD(P)H不稳定，此时可使用测葡萄糖的紫外分光光度法试剂盒，对已知浓度的葡萄糖标准品进行终点法测定，此法产生与葡萄糖相等摩尔数的NAD(P)H，故不难从吸光度变化求出K值，也有人用乳酸脱氢酶测已知量的丙酮酸来求K值。

　　五、连续监测法中的干扰因素及其控制

　　大多数测定标本不是纯酶制剂，而是体液或组织液。其中除了测定酶外，还存在着其它酶和各种物质，如使用酶偶联反应，在反应体系中又外添了大量的各种酶制剂，因此在反应体系中可能出现一些我们不希望的副反应或旁路反应，这些都有可能对测定反应产生干扰。

　　（一）其它酶和物质的干扰

　　如组织匀浆中往往含有NADH-细胞色素C还原酶，它将干扰各种还原酶的测定。临床酶测定中最典型的例子是血液中丙酮酸对丙氨酸氨基转移酶测定的干扰，由于反应体系中含有大量乳酸脱氢酶和NADH，可与丙酮酸反应消耗NADH，引起340nm处吸光度下降，假如将此NADH下降也算为ALT活性将引起误差。其它如红细胞中腺苷酸激酶（AK）对CK测定的干扰，在CK的酶偶联体系中ADP是CK底物，但它又同时是AK的底物，二个酶反应都产生ATP，在工具酶（已糖激酶和6-磷酸葡萄糖脱氢酶）作用下都产生NADH引起340nm处吸光度上升，其结果是CK测定结果偏高，为避免此种干扰，所以在反应体系中加入AK的抑制剂AMP和二腺苷酸5′磷酸。

　　（二）工具酶的污染

　　目前试剂中所用的试剂酶多从动物组织或细菌中提取，不可避免地会污染有其它酶，如不注意此问题，会引起不正确结果，例如丙酮酸羧化酶催化下列反应：

　　可加入苹果酸脱氢酶和NADH进行测定，将草酰乙酸转变为苹果酸，并将NADH转变为NAP⁺。如果工具酶苹果酸脱氢酶不纯，含有乳酸脱氢酶，也可以作用底物之一的丙酮酸，同时消耗NADH，这样就无法准确测定丙酮酸羧化酶活性。

　　更有甚者，有些工具酶中就混有测定酶，这种情况下，将产生很高的本底。

　　所以所用的工具酶必须很纯，并检查污染酶的含量，例如测定天冬氨酸氨基转移酶所用的苹果酸脱氢酶中所含杂的AST时，按IFCC规定不应超过0.005％。

　　（三）非酶反应

　　有些底物不稳定，没有酶的作用就能自行反应，例如ALP的底物磷酸对硝基酚配成的底物溶液，室温放置过夜，即自行水解释放出对硝基成黄色。又如测醛缩酶时，其底物醛类化合物可以和NAD⁺起非酶反应产生一种具有类似NADH吸收光谱的化合物，给测定带来困难。

　　（四）分析容器的污染

　　如冲洗不当，分析容器和管道中混杂有各种物质，可能影响酶活性，如微量重金属可使酶失活，残留的表面活性剂可能抑制酶活性。

　　（五）沉淀形成

　　使用光学法监测酶反应时，如有沉淀形成或组织匀浆中颗粒的下沉都会引起吸光度变化，引起测定结果误差，此情况常见于底物溶解度低而反应体系中底物浓度偏高。可见于用γ-谷氨酰对硝基苯胺为底物测GGT时。

　　对上述的一些问题常可通过试剂空白管检出并加以校正。不同厂家的ALT，AST试剂盒由于杂酶存在，试剂空白管可以测出多少不等转氨酶活性，个别可达5U/L以上，这种试剂无法使用，较好的试剂盒也在2U/L左右。如不作试剂空白管对结果加以校正，所测结果将偏高，用半自动分析仪测定酶时特别要注意作试剂空白管，有时还需作标本对照管，例如测ALT时为除去GLD的干扰，可以在底物溶液中不加入丙氨酸，与标本中GLD作用引起NADH下降。

　　解决这些问题另一个有效措施就是不用单一试剂测酶活性，改用双试剂，先加的第一试剂常不含底物或底物之一，但含有所有其它成分，与标本作用一段时间待吸光度停止变化后，再加入底物开始测定酶的反应。

（杨振华）