植物转脂蛋白的抗病机制研究进展

　　Van  Loon  等发现在病原物胁迫或其他病理条件下植物会合成一些蛋白质，如葡聚糖酶、几丁质酶、过氧化物酶、及其他相关蛋白酶和蛋白酶抑制剂等。1994年人们将这些由病原物诱导产生的特异性蛋白质统称为病相相关蛋白(PRs)。PRs  不仅在感染部位积累抑制病原物的生长和蔓延，而且与植物系统性获得抗性(SAR)的产生相关。此外，植物为抵御病原菌的攻击和自我保护，在遭受侵染后，还能诱导产生一系列其他抗性物质，抗菌肽(AMPs)即为其中一类。抗菌肽存在于大多数植物中，已知的植物抗菌肽均含偶数个半胱氨酸残基(4，6或8个)，它们两两配对形成分子内二硫键，起到稳定结构的作用。根据氨基酸组成和序列的差异，植物抗菌肽可分为不同的家族，包括硫素(thionin)、防御素(defensin)、转脂蛋白(LTP)、hevein  和  knottin  类抗菌肽等。

　　受病原菌诱导而过量表达的硫素、防御素和转脂蛋白能不同程度特异性抑制各种病菌的生长，因此，1998年在第五届国际植物病程相关蛋白专题研讨会上将上述3种抗菌肽也列入  PR  家族并分别命名为  PR-12(防御素)、PR-13(硫素)和  PR-14(转脂蛋白)。目前已确定的  PRs  有14种(表1)，它们属于不同蛋白家族，抗菌机制各不相同。本文主要介绍植物转脂蛋白的抗病机制研究进展。同时，我们从中国大白菜中发现的钙调素结合蛋白  BP-10  是一种新的植物转脂蛋白以及拟南芥  LTP1  具有钙调素结合活性的研究结果，为阐明  LTP  抗性机制提供了新的研究线索和思路。

1  植物转脂蛋白的结构与功能

　　根据分子质量的不同，转脂蛋白家族分为两类即  LTP1  和  LTP2，前者分子质量约为  9—10  Ku，后者分子质量约为  7  Ku。因目前对  LTP2  的研究很少，本文仅讨论  LTP1。LTP  是一类广泛存在于高等植物的碱性小分子蛋白，pI  约为9，由91—95个氨基酸残基组成，缺乏色氨酸。分子组成中最重要的特点是含有8个位置高度保守的半胱氨酸，其分布模式为  2/3-C-8-12/15-CC-19-C-1-C-21/23-C-13-4/8(其中  C  表示半胱氨酸，数字表示间隔的氨基酸残基数)。核磁共振、红外和  Raman  光谱分析表明  LTP  主要由4个(α-螺旋组成，螺旋间通过4对二硫键连接，形成非常稳定的结构，分子内有一个疏水空穴，可结合和容纳脂肪酸分子(图1(a))。研究表明转脂蛋白  N-端含有一个由21—27氨基酸残基组成的信号肽结构，为分泌型蛋白。关于  LTP  的功能和作用机制已争论多年，根据不同实验结果，几种假说相继被提出。首先，Kader  等认为  LTP  参与胞内磷脂的转运、生物膜的合成和胞内脂肪酸代谢库的调节。然而蛋白  N-端信号肽的发现和胞外定位，使人们开始重新认识  LTP。Pyee  等提出在角质层形成过程中  LTP  可能参与角质层单体的转运，并且在角质层和胞壁界面之间确实观察到了  LTP  的存在。最近，Carvalho  等通过免疫电镜和蔗糖密度梯度离心分析结果认为除细胞壁外，LTP  还存在于胞内细胞器及与脂类代谢相关的区域如乙醛酸循环体和一些蛋白贮存颗粒中。因此，认为  LTP  可能至少存在两类异构体：一类存在于胞外，执行防御功能；另一类则位于胞内不同的区域，执行脂类转运等功能．近年来的研究表明  LTP  在植物防御机制中起重要作用，它能被病原菌诱导而过量表达，并能抑制病原菌的生长和诱导植物系统抗性的产生，也由此被命名为  PR-14。例如，大麦  LTP  在转基因烟草和拟南芥中的过量表达能显著增强植物对病原菌的耐受性。目前，尽管  LTP  抗病机制的研究信息有限，但一些重要的实验结果仍为阐明其作用机制提供了新的依据。

2  LTP抗性机制的研究2.1  LTP  可能干扰了  elicitins  触发的植物细胞致死性过敏反应

　　当病原物侵染植物后，会分泌一些对其生理功能极为重要并能引发植物抗性的物质，这些物质被称作激发子(elicitor)，包括蛋白质和一些小分子有机化合物。例如，一些真菌分泌的  elicitins  就是其中一类很独特的、具有固醇携带活性的蛋白质。由于很多真菌不能合成对其生存必需的固醇类物质，因此，elicitins  可能在宿主和真菌之间穿梭，将宿主的固醇类物质带回到病原菌，启动有性或无性繁殖。同时  elicitins  与固醇形成复合物后，与存在于植物细胞膜上的  elicitins  受体结合，引起植物细胞的过敏反应，从而激活植物体内的防御机制。最近，Buhot  等的体内竞争实验首次证明了  LTP  能与细胞膜上的  elicitins  受体结合，这一发现无疑对揭示  LTP  的抗病机制有重要意义。

　　比较  LTP  和  elicitins，两者似乎存在着某种很微妙的关系。elicitins  的分子质量与  LTP  相近，约为10  Ku，但与  LTP  没有序列上的同源性，6个位置保守的半胱氨酸残基成为  elicitins  的特殊标志，其形成3对二硫键稳定了分子的空间结构，并在分子内部形成一个能容纳固醇和脂肪酸分子的疏水穴。Blein  等认为  LTP  与  elicitins  之间虽没有序列同源性，但在空间结构上显著的相似性使它们能够竞争性结合相同的膜受体(图1(b))．由于两者与膜结合的方式不同产生不同的效应：elicitin-固醇复合物与受体结合后引起植物过敏细胞的死亡，而  LTP  则起到  elicitins  拮抗剂的作用，这种内源  LTP  和外源  elicitins  之间与同一受体的竞争性结合最终降低了植物细胞对  elicitins  的敏感性，抑制了细胞的死亡并诱导系统抗性的产生。目前这一假说受到广泛重视。

2.2  茉莉酸等脂类分子对  LTP  抗病作用的影响

　　脂类不仅是细胞的主要组成成分，而且一些脂质分子作为第二信使参与了动植物细胞功能的调节，在细胞信号转导中构成脂类信号通路。植物  LTP  分子中具有一个可容纳各类脂肪酸的可塑性疏水穴。Buhot  等研究了不同长度的脂肪酸(FA)、氧合脂类-茉莉酸(JA)及其前体亚麻酸(LA)对烟草  LTP  抗病功能的影响。受体竞争实验和脂结合分析结果表明，虽然  LTP  能与各类脂相结合，但惟有与  JA  的结合能显著增强  LTP  与质膜受体的特异性识别和亲和力。同时，用  LTP-JA  处理的烟草植物能显著提高抗病原物能力，而  LTP-FA，LTP-LA  复合物或LTP，LA  及  JA  单独存在时均无上述效应。因此，他们首次提出  LTP-JA  复合物是  LTP  的生物活性形式，也是  LTP  和  elicitin-固醇复合物与质膜受体的竞争性结合形式。转脂蛋白与其特异性亲脂配基的协同作用是增强抗菌活性的关键因素。JA  是不饱和脂肪酸亚麻酸在脂氧化酶的作用下生成的一种五元环氧合脂类。已经确认  JA  是植物应答各类损伤和病原物侵染产生的内源信号分子，参与了植物对各类胁迫的局部或系统性信号转导，但详细调节机制尚不清楚。作为脂类信号分子的代表，JA  与  LTP  的结合如何传递防御信息并引起植物系统性获得抗性已成为当前研究的热点。人们正在试图寻找  LTP-JA  复合物作为可移动信号引起植物远距离保护反应的实验证据。

2.3  LTP  具有细胞毒性作用

　　作为抗菌肽，LTP  除了通过可能的信号传递途径以及参与角质屏障的形成来增强植物的防御机能外，自身也具有一定的真菌致死作用。最近  Regente  等报道  Ha-AP10  (一种  LTP  )能通过改变细胞膜的通透性来杀死真菌，致死效应与使用剂量呈相关性，首次证明了  LTP  具有细胞毒性作用，也为合理解释  LTP  能直接抑制真菌生长提供了可靠的实验依据。研究发现，LTP  的细胞毒性并不伤害植物细胞本身，说明  LTP  靶分子仅存在于真菌细胞膜上。Ge  等报道了水稻转脂蛋白  LTP110  的抗真菌活性，并对其保守氨基酸进行点突变，研究  LTP110  结构与抗真菌活性的关系，为  LTP  具细胞毒性作用提供了又一证据。

3  钙调素可能参与植物转脂蛋白抗性功能的调节

　　目前广泛认为植物系统性获得抗性(SAR)是植物抵御病原物攻击，实现自我保护的重要信号转导系统。对  SAR  信号途径的研究和阐明可直接用于指导以基因工程方法培育抗病新品种和建立新的植物保护模式，有着极为重要的理论意义和实际应用价值。因此，人们从不同角度研究  SAR  的信号转导机制，特别是最近几年的研究为人们认识钙调素(  CaM  )在  SAR  信号途径中的作用提供了有价值的信息。Harding  等发现仅一个氨基酸突变(K115R)的  CaM  能明显增强转基因烟草对病原的抗性。Heo  等发现大豆在病原菌感染后30  min  内，能诱导  CaM  异构体  SCaM-4  和  SCaM-5  的大量表达，同时发现  SCaM-4  和  SCaM-5  在转基因烟草中的组成型表达能增强植物的广谱抗性，并诱导水杨酸(SA)非依赖性  SAR  的产生。随后，Yamaka  wa  等报道从烟草花叶病毒感染的烟草中分离了13种  CaM  异构体基因并分析了它们的表达图谱，发现感染后30  min  内  NtCaM1，2，3，4  被诱导表达而明显积累，而且  SAR  途径的信号分子  SA  也可诱导它们的表达。为了深入研究  CaM  的作用，Kim  和  Reddy  等也相继用标记  CaM  筛选了真菌和细菌处理过的水稻、拟南芥细胞及大豆叶片  cDNA  表达文库，分离并鉴定了两种新的  CaM  结合蛋白(CaMBP)  Mlo  和  PICBP。实验结果显示病原菌和外源  SA  均可强烈诱导这两种蛋白的表达和积累。说明  CaM  协同其结合蛋白一起参与了植物系统抗性功能的调节。至今，CaM  参与植物防御信号转导功能的调节已毋庸置疑，但其机制几乎一无所知，亦未见  CaM  与  LTP  相关性的报道。

　　本研究室经过多年研究，从中国大白菜中分离和鉴定了钙调素结合蛋白  BP-10。近期研究发现它是植物转脂蛋白家族成员，具有典型的  LTP  二级结构  CD  特征图谱及脂结合活性和抗真菌活性，并证明  LTP  具有  CaM  结合特性。为了进一步确认  LTP  为一类新的  CaMBP，揭示  CaM  和  LTP  之间的相互作用机制，我们根据  GenBank  提供的序列，克隆了拟南芥  LTP1。CaM-geloverlay  和  CaM  sepharose  Pull-down  分析结果表明拟南芥  LTP1  不但具有  CaM  结合活性，并具有与  BP-10  相同的  Ca2+  不依赖结合特征，即在无钙条件下(存在  EGTA  )也能与  CaM  结合。采用基因删除和缺失的方法我们构建一系列  LTP1  突变体，研究  CaM  的结合域，我们发现其  CaM  结合域并非计算机软件预测中的  BAA  结构，而是位于  LTP  C-末端的保守区域，这一区域正是  LTP  结合脂类的关键部位，提示  CaM  和脂类可能竞争性结合这一部位。   (责任编辑：泉水)

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