成功研制登革热病毒样粒子

(深圳生新生物科技有限公司, 中山大学医学院)

流行病学

我国登革热的主要传播媒介是埃及伊蚊和白纹伊蚊。前者分布于南方沿海，如海南岛等地区，后者则在南北地区广泛存在，以长江以南为普遍。伊蚊体中小型、黑色，有银白色斑纹，幼虫孳生于小容器积水中，白天吸血。当伊蚊叮吸病人或隐性感染者后，病毒进入蚊体内，在蚊的唾液腺及神经细胞中大量复制，8～12天后当再叮吸正常人血时，病毒随唾液排出进入人体内，造成感染。伊蚊可终生携带和传播病毒，并可经卵将病毒传给后代。

本病的流行与蚊密度有关，流行季节一般在每年的5～11月，高峰在7～9月

(一)传染源 患者和隐性感染者为主要传染源，未发现健康带病毒者。患者在发病前6～8小时至病程第6天，具有明显的病毒血症，可使叮咬伊蚊受染。流行期间，轻型患者数量为典型患者的10倍，隐性感染者为人群的1/3，可能是重要传染源，丛林山区的猴子和城市中某些家畜虽然有感染登革病毒的血清学证据，但作为传染源，尚未能确定。

(二)传播媒介 伊蚊，已知12种伊蚊可传播本病，但最主要的是埃及伊蚊和白伊蚊。广东、广西多为白纹伊蚊传播，而雷州半岛、广西沿海、海南省和东南亚地区以埃及伊蚊为主。伊蚊只要与有传染性的液体接触一次，即可获得感染，病毒在蚊体内复制8--14天后即具有传染性，传染期长者可达174日。具有传染性的伊蚊叮咬人体时，即将病毒传播给人。因在捕获伊蚊的卵巢中检出登革病毒颗粒，推测伊蚊可能是病毒的储存宿主。

(三)易感人群 在新疫区普遍易感。1980年在广东流行中，最小年龄3个月，最大86岁，但以青壮年发病率最高。在地方性流行区，20岁以上的居民，100%在血清中能检出抗登革病毒的中和抗体，因而发病者多为儿童。

感染后对同型病毒有免疫力，并可维持多年，对异型病毒也有1年以上免疫力。同时感染登革病毒后，对其他B组虫媒病毒，也产生一定程度的交叉免疫，如登革热流行后，乙型脑炎发病率随之降低。

发病机理

(一)免疫机理 初次感染登革病毒的人，临床上表现为典型登革热，不发生出血和休克；再次感染异型登革病毒时，病毒在血液中与原有的抗体结合，形成免疫复合物，激活补体，引起组织免疫病理损伤，临床上呈现出血和休克。
    经动物猴实验，以登革病毒作初次感染，发现病毒在病毒血症前已侵入附近淋巴组织，以后迅速扩展至全身淋巴组织，病毒血症消失后，病毒仍可在白细胞等组织细胞中复制，并再次进入血循环中，与抗体结合形成免疫复合物。第二次感染时，组织细胞中的病毒量比初次感染时明显增多，如将登革病毒抗体注入猴体内后，再以登革病毒攻击，其病毒量比对照组猴(注射无登革病毒抗体的猴)高51倍。同时也发现有登革病毒抗体者的白细胞培养病毒，其白细胞内病毒复制的阳性率比无抗体者的白细胞明显增高，以上实验证明病毒繁殖明显增加的原因与抗体存在有关。
    血清学研究证实，登革病毒表面存在原封不动种不同的抗源决定簇，即群特异性决定簇和型特异性决定簇，群特异性决定簇为黄病毒(包括登革病毒在内)所共有，其产生的抗体对登革病毒感染有较强的增强作用，称增强性抗体，型特异性决定簇产生的抗体具有较强的中和作用，称中和抗体，能中和同一型登革病毒的再感染，对异型病毒也有一定中和能力。二次感染时，如血清中增强性抗体活性弱，而中和抗体活性强，足以中和入侵病毒，则病毒血症迅速被消除，患者可不发病，反之，体内增强性抗体活性强，后者与病毒结合为免疫复合物，通过单核细胞或巨噬细胞膜上的Fc受体，促进病毒在这些细胞中复制。称抗体信赖性感染增强现象(Antibody-dependent enhancement,ADE)，导致登革出血热发生。有人发现Ⅱ型登革病毒株有多个与抗体依赖性感染增强现象有关的抗源决定簇，而其他型病毒株则无这种增强性抗原决定簇，故Ⅱ型登革病毒比其他型病毒易引起登革出血热。
    增强性抗体和中和抗体在体内并存时，只有当中和抗体下降到保护水平以下时才能发生ADE现象。婴儿通过胎盘从母体获得登革病毒抗体后，初次感染登革病毒可以发生登革出血热。有人研究6～8月龄婴儿血清中登革病毒中和抗体已降到保护水平以下，而增强性抗体还在有效浓度内，如遇上登革病毒流行，则易患登革出血热，这与临床上登革出血热婴儿多数是6～8月龄是相符合的。
    含有登革病毒的单核细胞，在登革病毒抗体的存在下大量繁殖并转运到全身，成为免疫反应的靶细胞，由活性T细胞激活单核细胞，释放各种化学介质，激活的T细胞本身亦可释放一系列淋巴因子。这些生物活性物质激活补体系统与凝血系统，使血管通透性增加，DIC形成，导致出血和休克。患者血中组胺增高，组胺可扩张血管，增加血管通透性，Ⅰ型变态反应参与存在。登革病毒抗原与有Fc受体和病毒受体的血小板相结合，登革病毒抗体与血小板上的病毒抗原结合，产生血小板聚集、破坏，导致血小板减少，患者骨髓呈抑制，血小板生成减少。血小板减少可导致出血，还可影响血管内皮细胞的功能。免疫复合物沉积于血管壁，激活补体系统，引起血管壁的免疫病理损伤，Ⅲ型变态反应也参与发病。
病毒的变异.
    登革热和登革出血热的不同临床表现与病毒的变异有关。通过塔希堤、斐济等太平洋岛屿的流行病学观察，发现不少初次感染的登革热病人也出现登革出血热临床经过，病人的血清反应也属初次感染类型，且儿童占多数。有人认为登革病毒感染的临床病情轻重与病毒的毒力有关。登革病毒通过变异产生毒力更强的病毒株可能是登革出血热发生的重要原因.

发病症状

1．所有患者均发热。起病急，先寒战，随之体温迅速升高，24小时内可达40℃。一般持续5～7d，然后骤降至正常，热型多不规则，部分病例于第3～5d体温降至正常，1日后又再升高，称为双峰热或鞍型热。儿童病例起病较缓、热度也较低。
    2.全身毒血症状 发热时伴全身症状，如头痛、腰痛，尤其骨、关节疼痛剧烈，似骨折样或碎骨样，严重者影响活动，但外观无红肿。消化道症状可有食欲下降，恶心、呕吐、腹痛、腹泻。脉搏早期加快，后期变缓。严重者疲乏无力呈衰竭状态。
    3．皮疹 于病程3～6日出现，为斑丘疹或麻疹样皮疹，也有猩红热样皮疹，红色斑疹，重者变为出血性皮疹。皮疹分布于全身、四肢、躯干和头面部，多有痒感，皮疹持续5--7日。疹退后无脱屑及色素沉着。
    4．出血 25～50%病例有不同程度出血，如牙龈出血、鼻衄、消化道出血、咯血、血尿等。
    5．其他 多有浅表淋巴结肿大。约1/4病例有肝脏肿大及ALT升高，个别病例可出现黄疸，束臂试验阳性。
    （二）轻型登革热  表现类似流行性感冒，短期发热，全身疼痛较轻，皮疹稀少或无疹，常有表浅淋巴结肿大。因症状不典型，容易误诊或漏疹。
    （三）重型登革热  早期具有典型登革热的所有表现，但于3～5病日突然加重，剧烈头痛、呕吐、谵妄、昏迷、抽搐、大汗、血压骤降、颈强直、瞳孔散大等脑膜脑炎表现。有些病例表现为消化道大出血和出血性休克。
    二、登革出血热：分为两型即较轻的登革出血热和较重的登革休克综合征。
    （一）登革出血热 开始表现为典型登革热。发热、肌痛、腰痛、但骨、关节痛不显著，而出血倾向严重，如鼻衄、呕血、咯血、尿血、便血等。常有两个以上器官大量出血，出血量大于100ml。血浓缩，红细胞压积增加20%以上，血小板计数＜100×109/L。有的病例出血量虽小，但出血部位位于脑、心脏、肾上腺等重要脏器而危及生命。
    （二）登革休克综合征 具有典型登革热的表现；在病程中或退热后，病情突然加重，有明显出血倾向伴周围循环衰竭。表现皮肤湿冷，脉快而弱，脉压差进行性缩小，血压下降甚至测不到，烦燥、昏睡、昏迷等。病情凶险，如不及时抢险，可于4～6小时内死亡。

研发登革热病毒样粒子疫苗背景

登革病毒（Dengue virus, DEN）是登革热、登革出血热/登革休克综合征（DHF/DSS）的病原体，以埃及伊蚊和白纹伊蚊为传播媒介，广泛流行于全球热带及亚热带的60多个国家和地区，每年超过一亿人受感染，25亿以上的人受到威胁，登革病毒的传播现已经成为热带、亚热带地区严重的公共卫生问题。自1978年以来，我国南方不断发生登革热的流行，随着“温室效应”、全球气候变暖，城市常住和流动人口大规模增加和居住地环境卫生差，使得登革热的爆发和流行范围有逐年扩大和愈演愈烈之势。例如，近年来在我国，登革热已经由以往的广东、广西、海南、香港、澳门等地，逐步扩散到福建和浙江，甚至在上海也发现了可以感染和携带登革热病毒的埃及伊蚊。迄今，登革病毒的致病机制尚未完全明了，也缺乏有效的疫苗可供预防，因此，WHO及我国已将登革病毒致病机制及其疫苗的研究列为重要的研究课题。

登革病毒疫苗的研究已有近60年的历史，目前虽然有几种登革病毒候选疫苗进入不同的研究阶段，但目前尚无安全有效的疫苗被批准使用。由于登革病毒有四个血清型，DHF/DSS的发病机制可能与ADE有关，即初次感染产生的型特异性抗体不仅对其他型别的登革病毒没有交叉免疫保护作用，甚至在异型病毒二次感染时还可能增强病毒的感染，导致更为严重的DHF/DSS。因此，唯一安全有效的登革疫苗的研究战略应该是：研制四个血清型的登革病毒疫苗，即由四种血清型登革病毒有效免疫原构成的、可以同时刺激人体产生相应抗体，并抑制四个型病毒中任何一种型别病毒的四联多价疫苗。

登革病毒可以在蚊传代细胞和一些动物的传代细胞上繁殖，但病毒的产量很低，且病毒的繁殖特性不稳定，不适合于直接研制成弱毒或灭活疫苗。而比较高产的鼠脑源性病毒，也因为异源性和毒力不稳定，而难于开发成有效的用于人类的疫苗。目前，登革热疫苗的研究主攻方向主要在两个方面：

一是减毒活疫苗的研制。目前，登革热减毒活疫苗的研究已取得较大的进展，国外已筛选出登革病毒1、2、3、4型的减毒活疫苗候选株，并对这些疫苗株进行了安全性和免疫效果评价。此外，一种包括4个型别登革病毒的联合减毒活疫苗的试验也在进行中，接种者可同时对4个型病毒产生抗体，从而可避免单一型疫苗免疫后再受另一型病毒感染时可能发生的ADE现象。但是，由于登革热减毒活疫苗的研究条件要求高，研究的资金投入大，特别是因为，四个型登革病毒株的毒力和毒价的差异，造成四个嵌合型的减毒疫苗株在免疫有效性上，存在着明显的不同，因此，WHO专家预测，在十年之内，这种疫苗不会面世。

二是基因工程疫苗的研制。利用各种工程菌株，在体外高效表达和生产上述四个血清型的登革病毒的免疫原，以研发登革热亚单位疫苗。研究较多的有DEN重组 NS1蛋白、E蛋白和PreM-E-NS1融合蛋白、单价或多价的DNA疫苗、多种型别的嵌合疫苗以及基因工程活疫苗等。

许多病毒的壳蛋白可以在体外培养细胞体系自行形成病毒样的粒子结构，称为病毒样颗粒，其实质上是一种没有核酸核心的空壳粒子，但具有与天然病毒颗粒相似的免疫原性，又避免了天然病毒的感染性，成为理想的疫苗候选单位。近年来，国内外不同研究小组分别利用重组杆状病毒载体、重组腺病毒载体以及其它真核表达载体在昆虫细胞系、哺乳动物细胞系或酵母细胞系获得了HPV、HIV-1、JEV、HCV和DEN2等病毒样颗粒，有的已进行了动物免疫保护试验，显示可产生中和抗体，对攻击感染具有免疫保护作用，具有良好应用前景。

成功研发登革热病毒样粒子疫苗攻关单位:

香港测立知科技有限公司和深圳生新生物科技有限公司由美国和澳大利亚的科学家组成的团队, 在自己不同的领域, 发挥优势, 致力于将重组基因工程技术, 研制各类抗体和抗原和各种免疫测试法两大关键技术相结合, 现在我们已经将最新科研的成果应运到医学临床上, 成功研发出多项快速测试盒, 如肺结核, 幽门螺旋杆菌, 肠病毒71型等疾病系列, 梅毒和淋病的性病系列, 怀孕快速和排卵测试剂的贺尔蒙系列和可用唾液及尿液测试11种大类非法药物的快速测试盒的滥用毒品系列.

协作单位中山大学基础医学院是国内研究登革病毒力量最强的单位，多年来，研究小组分别在细胞水平、分子水平和基因水平上对登革病毒致病与免疫机制进行了系列研究，研究结果初步阐明了登革病毒与人血管内皮细胞及单个核细胞的相互作用；首次证明了人血管内皮细胞表面存在登革病毒特异性受体；首次报道在酵母菌中高效表达具有生物学活性的全长E蛋白，并证明了E蛋白在病毒致病与免疫中的作用；精确测定了E蛋白的抗原表位。该研究在国内外发表相关学术论文共30余篇，研究结果为最终阐明登革病毒致病与免疫机制提供了重要的科学依据，并在疫苗研制及寻找抗登革病毒药物方面具有重要意义。

成功研发登革热病毒样粒子疫苗技术

病毒样粒子结构疫苗是将基因工程这种现代分子生物学的核心技术与细胞工程、发酵工程等技术结合起来，根据不同病毒疫苗的要求和特点，利用强有力的酵母或其他真核表达系统，人工的设计和生产只含有自然病毒粒子所有的结构蛋白，而不含有病毒核酸的病毒疫苗。这种疫苗只引起人体的免疫反应，而不引起任何的病毒感染，具有自然病毒感染时相似的免疫原性，但不具有病毒的感染性，因此，具有100%的安全性。另外，应用这项技术研发的病毒样粒子结构疫苗还有很多优点.

研究小组采用的是世界卫生组织指定的标准病毒株。 登革热一型病毒毒株是夏威夷分离株；二型病毒是巴布亚-新几内亚分离株（DEN2-NGC）；三型病毒是H-87分离株；四型病毒是H241-P分离株, 并成功应用酵母表达系统，高效生产了多种生物学活性很好的抗菌活性物质。所用酵母工程菌自动将准确表达的病毒结构蛋白（CpreM,E），以自然构像的病毒样粒子释放到酵母菌的培养上清中，有利于亚单位疫苗的工业化生产和纯化。在国际和国内都属于生物高技术的前沿。目前，我们已经成功利用这一高效的酵母菌表达系统，构建和表达四种以上登革病毒的核蛋白、膜蛋白前体和壳蛋白基因构成的复合基因，已经获得分泌型的登革病毒的病毒样粒子结构。从效益分析讲，我们生产的登革病毒蛋白的亚单位疫苗可以达到每升培养物10毫克以上的产量，而免疫原的激活有效免疫的浓度只是微克水平。并且在中山大学基础医学院的协助下, 成功得到登革热病毒样离子结构电子显微镜照片和免疫原性实验的结果.

登革热病毒样粒子显微镜照片

研究小组随着研究方法的改进，目前，这一系统不仅接近于真核表达系统，可以对所表达的产物进行一定的表达后修饰和糖基化，以及形成正确的蛋白结构等，而且酵母表达更易操作，并可形成规模化生产。实践证明，酵母系统表达的乙肝表面抗原构成的乙肝疫苗和其它众多的，由该系统表达的生物活性物质，都已经广泛的应用于医学和生物学研究和生产的实践中。也是世界卫生组织推荐的疫苗项目.

深圳生新生物科技有限公司和协作单位(中山大学基础医学院)的研究成员包括多名国外知名学府的博士、博士后。他们曾在世界卫生组织在美国.新西兰、加拿大和澳大利亚的专门从事病毒和疫苗研究的机构中长期从事登革病毒的研究工作，并完成了登革热疫苗研究的博士论文和博士后研究项目。他们所研究的四个血清型的登革病毒基因工程亚单位疫苗，在实验动物模型显示了强的保护力（100%），达到了该研究领域的国际前沿。曾被世界病毒大会邀请为大会发言和在2006年世界生物科技展览会，引起了国际同行的很大兴趣。并且被邀请在2006年11月6-9日在加拿大蒙特利尔参加世界免疫疗法及疫苗大会发言和参展.

项目的目标、结果和效益：

病毒样粒子结构的登革四联疫苗是一种全新的疫苗研发的策略。他将为香港地区和我国，乃至全世界生活在热带和亚热带受到登革病毒威胁的人们带来免受病毒感染的的希望。这种新型的疫苗有着广阔的市场。也必将为人民的健康带来实惠。

成功研发这种新型疫苗，需要采用包括基因工程、发酵工程等各种生物高新技术。这些将有助于提升香港地区和我国在病毒疫苗方面的研发水平，提高我们在国际上的竞争能力.

本项目是以在香港测立知科技有限公司,深圳生新生物科技有限公司和国内著名医学高校（中山大学医学院）之间的全方位合作。项目将整合国内知名教授，国外学者和留学生、中山大学医学院的老师、学生等各方面的宝贵资源，已经完成登革病毒疫苗的攻关。

登革热在香港是危害非常严重的传染病。同时也严重的威胁着整个大珠江三角洲地区的国民经济和人民生命财产的安全。利用病毒样粒子结构疫苗这种疫苗研发的最新策略和技术路线，研发出登革病毒疫苗，将会给香港和整个大珠江三角区带来实实在在的利益、人民生命财产的安全、社会的稳定，和更快的经济发展。