图1-7 免疫细胞化学（蛋白A-胶体金法）和原位杂交术示大鼠垂体

催乳素细胞电镜像 N催乳素细胞核
↑分泌颗粒内显示金粒

粗面内质网（RER）显示银粒

（加拿大Douglas医院研究中心童毅爱博士赠图）

　　标记抗体民被检抗原的结合方式有两种。一是直接法，即如上述用标记抗体与样品中的抗原直接结合（图1－8）。这种方法操作简便，但敏感度不及间接法。间接法是将分离的抗体（第一抗体简称一抗）再作为抗原免疫另一种动物，制备该抗体（抗原）的抗体（第二抗体简称二抗），再以标记物标记二抗。先后以一抗和标记二抗处理样品，最终形成抗原一抗－标记二抗复合物（图1－8）。间接法中的一个抗原分子可通过一抗与多个标记二抗相结合，因此它的敏感度较高，而且目前国内外均有多种标记二抗商品供应，使用方便。间接法中较常用的是一种称之为过氧化物酶－抗过氧化物酶复合物法（peroxidase-antiperoxidase complex method,PAS法），该法除需一抗和二抗外，还需制备HRP标记的抗酶抗体，即以HRP作为抗原免疫动物，制成抗HRP抗体，再以HRP标记该抗体制成由3个酶分子与2个抗酶抗体组成的相当稳定的环形PAP复合物。标本先后以一抗、二抗和PAP复合物处理后，再以DAB显色，即可检测抗原的分布。此法由于细胞内的抗原通过抗体的层层放大而与多个酶分子结合，因此敏感性很强（图1－9）。

图1－8 免疫细胞化学直接法（A）与间接法（B）示意图

图1－9 免疫细胞化学PAP法示意图

　　免疫细胞化学术近10年来又有新进展，如生物素－亲合素等新颖试剂的应用，为检测微量抗原、受体、抗体开辟了新途径。生物素（biotin）又称维生素H，是从卵黄和肝中提取的一种小分子物质（分子量244.31）；亲合素（avidin）又称卵白素，是从卵白中提取的一种糖蛋白（分子量68kD）。每个亲合素分子有生物素结合的4个位点，二者可牢固结合成不可逆的复合物。生物素－亲合素的应用大致有三种方法。①标记亲合素－生物素法（labelled avidin- biotin method,LAB法）：将亲合素与标记物（HRP）结合，一个亲合素可结合多个HRP；将生物素与抗体（一抗与二抗）结合，一个抗体分子可连接多个生物素分子，抗体的活性不受影响。细胞的抗原（或通过一抗）先与生物素化的抗体结合，继而将标记亲合素结合在抗体的生物素上，如此多层放大提高了检测抗原的敏感性（图1－10）。②桥连亲合素－生物素法（bridged avidin-biotin method,BAB法)：先使抗原与生物素化的抗体结合，再以游离亲合素将生物素化的抗体与酶标生物素搭桥连接，也达到多层放大效果（图1－10）。③亲合素－生物素－过氧化物酶复合物法（avidin-biotin-peroxidase complex method,ABC法）；此法是前两种方法的改进，即先按一定比例将亲合素与酶标生物素结合在一起，形成亲合素－生物素－过氧化物酶复合物（ABC复合物），标本中的抗原先后与一抗、生物素化二抗、ABC复合物结合，最终形成晶格样结构的复合体，其中网络了大量酶分子，从而大大提高了检测抗原的灵敏度（图1－10）。现有配制现成的ABC药盒商品供应，操作简便，是目前广泛应用的一种方法。

图1－10 生物素－亲合素免疫细胞化学示意图

（1）标记亲合素－生物素法
（2）桥连亲合素－生物素法
（3）亲合素－生物素－过氧化物酶复合物法（ABC法）

　　（五）同位素示踪术

　　同位素示踪术是用放射性核素的射线作用，研究细胞对某种物质的吸收、合成、转运和分泌等代谢过程。将放射性核素或其标记物注入动物体内或加入细胞培养的培养基内，细胞摄取该物质后，取被检组织制成切片或细胞涂片。可用显微镜放射自显影术（microau toradiography）检测该放射性物质在细胞内的原位分布及其代谢转归，即将薄层感光乳胶涂在切片或涂片的表面，标本在暗盒内保存一定时间后，细胞内的放射性核素产生的射线使乳胶中的溴化银还原为银粒，经显影和定影后在光镜下观察银粒的分布。β射线能量低，射程短，电离作用强，常用的β射线核素是³H、¹⁴C、³²P、³⁵S、⁴⁵Ca、¹³¹I。如用³H－胸腺嘧啶核苷研究细胞DNA合成及细胞增殖动态（图1－11）。用³⁵S－蛋氨酸研究某些腺细胞分泌物的合成与排泄，用¹³¹I－碘化钠研究甲状腺素的合成等。还可做标本中的银粒数计量或其光密度测定，进行定量分析。另外，也可用液体闪烁计数器测定分离细胞或其匀浆的放射线强度，进行定量研究。

　　（六）原位杂交术

　　原位杂交术（in situ hybridization）是一种核酸分子杂交技术，它是通过检测细胞内mRNA和DNA序列片段，原位研究细胞合成某种多肽或蛋白质的基

图1－11 大鼠肝大部切除后再生过程中增殖期肝细胞

摄取³H标记的胸腺嘧啶核苷放射自显影像×1000
↑ 增殖期肝细胞核

　　因表达。其基本原理是根据两条单链核苷酸互补碱基序列专一配对的特点，应用已知碱基序列并具有标记物的RNA或DNA片段即核酸探针（probe），与组织切片或细胞内的待测核酸（RNA或DNA片段）进行杂交，通过标记物的显示，在光镜或电镜下观察目的mRNA或DNA的存在与定位。此项技术需首先制备某种核酸探针，其种类主要有三种：①利用大肝杆菌重组带有目的基因的质粒DNA，制成互补DNA探针(cDNA);②应用限制性核酸内切酶消化制成线性DNA模板，在体外转录获得反意RNA探针(cDNA);③依照待测核酸的核苷酸序列，应用DNA合成仪合成寡聚核苷酸探针。cRNA和cDNA的常用标记物有³²S、³²P、³H等放射性核素和荧光素、生物素、地高辛等非放射性物质。组织学应用的原位杂交术主要是染色体原位杂交和细胞原位杂交。前者是研究遗传基因、抗原基因、受体基因、癌基因等在染色体上的定位与表达；后者是研究细胞某种蛋白质的基因转录物mRNA在胞质内的定位与表达（图1－7，1－12）。核酸分子杂交术有很高的敏感性和特异性，它是免疫细胞化学的基础上，进一步从分子水平探讨细胞功能的表达及其调节机制的，已成为当前细胞生物学、分子生物学研究的重要手段。

图1－12 原位杂交术光镜像

A ³²P标记胰岛素cRNA探针放射自显影显示大鼠胰岛B细胞内胰岛素mRNa ×400
B 地高辛－碱性磷酸酶标记胰岛素cRNA探针显示大鼠胰岛B细胞内胰岛素mRNA ×400
C 地高辛－碱性磷酸酶标记心钠素cRNA探针显色示体外培养的人胎儿脐静脉
内皮细胞内的心钠素mRNA ×850
（第三军医大学蔡文教授供图）

　　（七）细胞和细胞化学定量术

　　组织和细胞形态结构及其化学成分的定量研究，是以量的测定及其数据变化阐述组织和细胞的生长、分化、代谢和功能的演变以及对环境因素和致病因素的反应。生命科学的研究不断深入，定量技术的应用日益广泛并有所进展。

　　1、显微镜分光光度定量术此方法是应用显微分光光度计（microspectrophotometer）测定组织化学和免疫组织化学染色标本的反应强弱，进行化成分的定量分析的。基本原理是细胞内某种物质的含量不同，其染色反应的深浅不一，对一定波长的光吸收也就不同，即某物质的消光度与一定厚度和面积内的该物质浓度成正比。通过光电组合自动控制系统将消光度转换为电信号，即可得出光密度值（O、D值），进行定量分析比较。前述荧光素染色、酶和核酸组织化学染色、多肽和蛋白质免疫组化染色、放射自显影和原位杂交等标本，均可应用显微分光光度计做定量分析。

　　2、形态计量术 形态计量术（morphometry）是运用数学和统计学原理对组织和细胞进行二维和三维的形态测量研究，如细胞及其微细结构成分的数量、体积、表面积、周长等的相对和绝对值的测量，其中三维立体结构的研究又称体视学（stereology）。机体组织的光镜结构计量已有不少有意义的资料，如人和动物的肺泡数量和表面积，肾小体的数量和体积比，肝细胞的体积和数量，胰岛的数量及各类细胞的数量比，腺垂体各种内分泌细胞的数量比等。通过组织切片或照片（光镜和电镜）平面图像的测量，推算其立体结构数值，传统方法是将测试系统（点、线、方格等）投影或覆盖在切片上或照片上，把若干样品的平面测量数据按数学公式推算出其立体数值。目前已广泛应用图像分析仪（image analyzer）进行形态计量研究，该仪器也是光学、电子学和计算机高技术产品，它是将切片或照片图像通过摄像机显示于监示器屏幕上，并根据不同结构的颜色深浅（灰度）及各像点的大小位置，快速准确地得出所需的各种形态数据。组织化学和免疫组织化学染色标本，也可应用图像分析仪测定其光密度值，进行定量分析。

　　3、流式细胞术 流式细胞术（flow cytometry,FCM）是近年建立的细胞分类和定量研究技术，它是应用流式细胞仪（或称荧光激活细胞分类器，fluroescent activated cell sorter）对单个细胞生物化学和生物物理特性进行快速定量测定的。工作原理是先分离被检细胞制成悬液，并作荧光染色或标记，使单细胞液流快速通过该仪器的激光器照射分析区，被检细胞产生的不同荧光信号转变为电脉冲，分别输入计算机内贮存，并显示于示波器屏幕上，即可获得该细胞群体中不同类型细胞的有关数据，如不同细胞的数量、荧光强度以及细胞体积、表面积和内部结构等参数；还可使细胞附有不同电荷，分类收集各种细胞，该技术的特点是速度快，精确性高，灵敏度大，已成为一种重要手段广泛用于细胞动力学、遗传学、免疫学、肿瘤学等的研究。如细胞DNA，RNA或某种蛋白质的含量分析，单个染色体DNA含量及分选，淋巴细胞膜抗原或受体的分析及细胞亚群分选，杂交细胞等的分选等，也用于肿瘤临床诊断及疗效和预后的分析等。

　　（八）电子显微镜术

　　1、透射电镜术 透射电镜（transmission electron microscope,TEM）是以电子束穿透样品（组织的超薄切片），经聚合放大后，显像于荧光屏上进行观察和摄片的。电镜的放大倍数的分辨率比光镜大得多，放大倍数为几万至几十万倍，分辨率可达0.2nm。标本制备较光镜的更严格，新鲜组织切成小块（lmm³），用戊二醛，多聚甲醛、四氧化锇等固定，树脂包埋，以超薄切片机切成厚50～80nm的超薄切片，经醋酸铀和柠檬酸铅等重金属电子染色后，置于电镜下观察，标本在荧光屏上呈黑白反差的结构影像。被重金属浸染呈黑色的结构，称电子密度高（electron-dense）；反之，浅染的部分称电子密度低（electron-lucent）,这种染色称正染色（positive staining）。若被染结构着色浅淡，而其周围部分染成黑,是称为负染色（negative stainning）。透射电镜的电子枪加速电压50～100kV，电子束穿透力低，近年制成加速电压500kV以上的超高压电镜，电子束穿透力很强，可观察0.5～10μm厚的切片，可观察细胞内骨架等的立体超微结构。应用电镜观察细胞化学染色标本，称电镜细胞化学术（electron microscope cytochemistry）；电镜观察免疫细胞化学染色标本，称免疫电镜术（immunoelectron microscopy）；电镜与放射自显影结合的方法称电镜放射自显影术（electron microscope autoradiography）。