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抗铜绿假单胞菌I-E型CRISPR-Cas的噬菌体蛋白质结构

时间:2018-01-03 10:31来源:生物催化剂设计与改造服务   作者:未知 阅读:

本研究首次对铜绿假单胞菌抗I-E型CRISPR/Cas系统蛋白AcrE1进行了结构解析,分析了AcrE1作用的机理,并且利用AcrE1蛋白将铜绿假单胞菌內源的I-E型CRISPR系统变成了基因组调控工具。

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CRISPR/Cas广泛存在于细菌和古细菌中,是细胞保护自身而进化来一种保护系统。CRISPR由不连续的重复序列(repeat)、长度相似的间隔区序列(spacer)和前导序列(leader)所组成。外源DNA上与CRISPR序列的间隔区相匹配的序列被称作原型间隔区(protospacer)。CRISPR序列的转录产物crRNA(CRISPR RNA)经剪切形成小RNA后与其上游保守基因编码的Cas蛋白形成核酸蛋白复合体(CRISPR-associated complex forantiviral defence, Cascade),识别并降解通过水平基因转移进入宿主菌的外源DNA。

CRISPR/Cas分为三大类型,分为I、II以及III型,其中I型分为A-F六个亚型,本研究研究的对象为E亚型的抗CRISPR蛋白。目前已有超过20种抗CRISPR蛋白被报道,抗CRISPR蛋白的由来也是进化的结果,噬菌体侵染细菌,在有自身保护的系统存在的前提下不被细菌内源的CRISPR系统所攻击直至破坏,而对应的保护机制则被称为抗CRISPR系统,不同的抗CRISPR作用的方式以及靶点不同。本研究通过蛋白质晶体结构技术,分析出AcrE1作用的靶点是Cas3蛋白,下面简单介绍下I-E型CRISPR系统。

 I-E型CRISPR/Cas系统由CRISPR序列和Cas蛋白(Cas1-3和CasA-E)组成,Cas1和Cas2蛋白通过识别位于靶标DNA原型间隔区3′端PAM基序,进而将原型间隔区DNA片段整合到自身CRISPR的重复序列之间,形成新的间隔区。当再次遭受类似外源DNA入侵时,cas基因转录并翻译成相关的Cas蛋白,其中包括Cas1-3和CasA-E(包括Cas1、Cas2、Cas7、Cas5e和Cas6e)。CRISPR转录为前体crRNA(pre-crRNA)经过核酸酶CasE(Cas6e)加工后形成成熟的crRNA。CasA-D形成Cascade复合体。与成熟crRNA继续结合的CasE招募。在Cas3的介导下,Cascade与再次入侵的外源DNA上原型间隔区相结合并在PAM位点附近切割靶标DNA,从而导致靶标DNA降解(图1)。通过分析I-E型CRISPR的作用方式不难看出,Cas3充当着对外源核酸切割的角色。于是抑制了Cas3的活性,I-E型CRISPR系统的Cascade也可以通过crRNA识别PAM结合到基因组相应的位置,如果结合到基因的启动子部位则可以行使CRISPRi的功能。

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图1 I-E型CRISPR系统的作用方式

结合晶体结构理性分析,通过生化手段得出AcrE1蛋白C端第91和92位碱基的作用至关重要。 

本研究成功分析出铜绿假单胞菌抗I-E型CRISPR蛋白AcrE1作用靶点是Cas3蛋白,在体内AcrE1可以阻止Cas3蛋白被招募,从而该I-E型CRISPR系统在有AcrE1蛋白存在的情况下可充当CRISPRi技术的角色,结合在启动子区的Cascade可被AcrE3蛋白(也是一种抗CRISPR蛋白)结合并移除(图2)。

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图2 本文构建的“CRISPRi”

(责任编辑:泉水)
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