除温度外，测定时条件的不同也可能引起结果明显差异。最突出例子是ALP测定，用二乙醇胺为缓冲液测出ALP结果比用氨基甲基丙烷为缓冲液的高2-3倍。又如在ALT测定时，如在底物中加入磷酸吡哆醛比不加者结果可增高20％-100％。正因为如此，为防止临床医生产生错觉，认为IU/L结果在国际上应一致。目前实验室常以U/L，而不以IU/L向临床报告。

　　总之，临床医师在分析酶测定结果（U/L）时应以给报告实验室的参考值为准，盲目套用文献结果或与其它实验室结果相比较，有可能得到不恰当的结论。

　　前面已提到从70年代以来，随免疫技术发展，出现利用酶的抗原性，通过抗原抗体反应直接测定酶的质量。测定结果不是以U/L报告而是直接用ng/ml，μg/L等报告酶蛋白含量高低。如临床医师看到这样的报告，就可知道此时使用了最新的免疫学方法测酶，其临床意义有可能与前两种方法结果有差异。例如国外公认，同样测CK-MB，用免疫学方法所测结果诊断价值最高，此问题将在后专门叙述。

　　（二）标本的采集、处理与贮存

　　在实验室测定酶之前，标本还要经过采集、分离血清和贮存等一系列处理过程。而酶在血中是处于一个动态变化过程，血液离开体内后，还会有一定变化。因此在其中任何一个阶段处理不当，都有可能引起测定值变化。

　　采取血液标本时最容易引起实验室误差的是抽血不当，或者实验室急于分离血清，因此体外溶血。由于大部分酶在细胞内外浓度差异明显，少量血细胞的破坏就有可能引起血清中酶明显升高。最明显例子是LD，红细胞中LD约为血清的100倍，这样，只要有轻度溶血，如1/100红细胞破坏，就足以使血清中LD升高一倍，常使原为正常的血清LD值超过参考值上限。其它如CK，虽然红细胞中无CK，但含有丰富腺苷酸激酶（AK），进入血清能使某些用“连续监测法”测定CK的值假性升高，红细胞中酶的干扰，不仅表现在溶血影响上，采血后如不及时将血清和血凝块分离，血细胞中酶同样可以透过细胞膜进入血清，所以采血后1-2小时实验室必须及时离心，分离血清。

　　除非测定与凝血或纤溶有关的酶，一般都不采用血浆而采用血清作为测定标本。大多数抗凝剂都在一定程度上影响酶活性，例如EDTA为金属离子螯合剂，在去除Ca²⁺同时也去除其中Mg²⁺、Mn²⁺等离子，Mg²⁺是ALP、CK和5′-核苷酸酶（5′-NA）作用的激活剂，其它如草酸盐、枸橼酸盐乃至肝素都对一些酶有一定程度抑制。有必要时，可考虑使用肝素为抗凝剂，在常用抗凝剂中它对酶影响最小的。

　　酶蛋白不稳定，易失活，ACP是最明显的一个例子。此酶在中性或碱性环境中极不稳定，血液在37℃放置1小时，ACP活性可下降50％。大部分酶在低温中比较稳定，分离血清如不能及时测定，应放冰箱保存，表（7-3）是常用酶在不同温度情况下的稳定性。

　　从表7-3可看出－25℃将血清冻结并没有太大优点，相反有些酶如ALD、ALT在融冻时被破坏。有文献报道用液氧在－195℃贮存血清，常用酶如ALT、AST、ALP、CK、LD、GGT和AMY，在10个月活性变化不大。个别酶如LD在低温反而不如室温稳定，即所谓的“冷变性”。

表7-3　酶在不同温度储存的稳定性（活性变化小于10％）

　　※酶不耐融化；

　　￥　标本未酸化；

　　§标本加枸橼酸到pH5

　　五、免疫方法测酶质量的临床应用

　　用免疫学方法测酶质量和经典的测酶活性方法相比，不仅灵敏度高，并可能测定一些以前不易测定的酶。但更为有意义的是：有可能为临床上的应用提供新的资料和信息。从疾病论断的角度来看，至少提供下列三个新的可能性：

　　（一）酶活性和酶质量变化的不平行

　　这二者的变化在不少情况下是互相平行的，但在一些情况下可以出现不一致。早在1987年Robert就提出可以用免疫学方法直接测量CK的质量，并声称：“由于RIA法是如此的敏感，并可测定血循环中无活性的CK-MB，毫不奇怪此法可比其它方法更早查出心肌梗死，一般在疼痛3小时就可升高。”此后有些学者在急性心肌梗死时比较测CK-MB活性和RIA法CK-B亚单位的结果，发现二者之间存在着不平行关系。CK-MB活性升高持续较短，3天左右；而CK-B亚单位酶蛋白升高却在7天左右。近几年来发展了用免疫学方法测CK-MB酶质量（mass）方法与测酶活性（activity）方法的结果相比较，在检测心肌坏死上，测质量方法明显优于测活性方法。

　　国内有人报告了用单扩法测酶活性的方法，测定了在各种患者血中超氧歧化酶（SOD）含量，证实有些患者血中存在着无活性的SOD。

　　在一些疾病情况下，甚至出现二者变化完全相反的情况。例如在狗实验性胰腺炎，用免疫学方法测弹性蛋白酶浓度，出现迅速而急剧地上升，但同时酶活性却出现平行地下降。作者解释在释放酶蛋白入血同时，有大量酶抑制剂也释放入血，以致出现相互矛盾结果。前面提到的用两种方法测前列腺酸性磷酸酶（PACP）来诊断前列腺癌的阳性率不一致，有作者也认为可能是肿瘤组织合成一些无活性或活性较低的酸性磷酸酶。

　　如果说在这方面尚有争论，那么在遗传学方面的意义则是比较明确的，将此两大类方法结合起来可以研究酶缺陷遗传疾病的发生机制，用免疫学方法可以测出灭活的酶蛋白量。由于基因缺陷引起的酶缺陷如果仅仅影响酶蛋白合成下降，酶活性与酶蛋白量的比率即所谓的“免疫比活性”无变化；如果由于基因缺陷合成了变异的酶蛋白，则不仅总酶活性下降，免疫比活性也将变化；如果合成了一种活性正常但结构不稳定的酶，则幼稚细胞中酶活性及质量都无变化，而在衰老细胞中将出现酶缺陷。酶稳定性的变异常见于红细胞内酶缺陷症。这是由于红细胞寿命较长，成熟红细胞无细胞核不能制造新蛋白质，所以酶稳定性的缺陷容易在衰老红细胞中表现出来。

　　在最严重的情况，变异的基因甚至能合成无活性的酶蛋白，如胆碱酯酶遗传变异中，有一类型所谓“不活动等位基因”（“silent ”allele）就是典型例子。又如在Lesch-Nyhau综合征中存在这免疫活性但无催化活性的次黄嘌呤转磷酸核糖基酶。

　　（二）以免疫方法取代测酶活性方法

　　免疫学方法和经典测酶活性方法相比最突出的优点是：免疫学方法能测定一些不表现酶活性的酶蛋白质，这在以前是不能想象的。首先是各种酶原，还有去辅基酶蛋白（apoenzyme）以及一些灭活的酶蛋白裂解产物等等。例如已有用RIA法测胰蛋白酶原。也有用免疫学方法测定线粒体和胞质谷草转氨酶，这其中包括无酶活性的去辅基谷草转氨酶。

　　免疫学方法另一特点是特异性高，且不受体液中其它物质，特别是抑制剂、激活剂的干扰。不少蛋白水解酶或者对基质特异性不高，或者易受血中一些蛋白质如α1-抗胰蛋白酶、α２－巨球蛋白的抑制作用。用测酶活性方法不易准确定量甚至无法测定。在近年来用免疫学方法陆续建立了RIA测胰蛋白酶、弹性蛋白酶的方法。

　　一般说来和测酶活性相比，免疫学方法灵敏度更高一些。一些既往由于方法学灵敏度差，不易测定的酶可以尝试改用免疫学方法，脂肪酶是其中例子之一。经典测酶活性方法由于灵敏度差，酶温育时间长达24小时，几经修改仍需4小时，现已有RIA法脂肪酶试剂盒。近年来随着优生学发展，羊水中各种成分包括酶的测定日益受到重视。例如在Tay-Sachs综合征时，胚胎组织细胞中氨基已糖苷同工酶A或（和）B合成障碍，免疫学方法由于灵敏度高，可以比测酶活性方法早几周在胎儿的羊水中查出此酶的缺陷。

　　（三）同工酶测定

　　免疫学方法用于测定同工酶比经典的理化方法简单方便，所以愈来愈多同工酶测定改用免疫学方法，国外已逐步取代电泳或层析法。除上文已提到的CK-MB、LD₁、LD₅测定外，还可用免疫学方法测半乳糖酰基转移酶同工酶A和B，碱性磷酸酶的Regan同工酶。同工酶有可能作为肿瘤的标记物（tumor marker），已证实γγ-烯醇化酶或神经元特异烯醇化酶（NSE）可作为APUD系统肿瘤的一个很好标记物。用RIA测血中NSE在肺小细胞性肿瘤患者中阳性率超过80％，γγ-烯醇化酶在大细胞肺癌阳性率也超过70％。可以预期随科学技术发展，免疫学方法将成为临床上测定同工酶的主要方法。

　　六、检测同工酶及其亚型的临床意义

　　从50年代中期开始，临床酶学有了迅速的发展，几乎把当时能测的酶都在临床上试用过，企图通过测定某一种或某几种酶来诊断一些特定疾病或特定组织器官的病变。通过10余年广泛的研究，发现酶测定诊断疾病的特异性并不高，因为机体中各种细胞的代谢有很大的相似性，从临床角度很难说存在着所谓器官特异酶。当时曾有学者想找出一些肿瘤特异酶，但很快发现找不到一种只存在于肿瘤组织并能进入血液而正常组织又不存在的酶。