在此同时，Market等通过对LD在电泳时可分为5个区带的深入研究，在1959年首先提出“isozyme”的术语来描述一类酶，它们催化同一生化反应，但在结构和理化性质上有所不同，目前广泛使用国际生化协会推荐术语“isoenzyme”。我国目前多翻译为同工酶，临床很快将此新概念、新发现用于临床，发现同工酶测定可以弥补上述测酶总活性的不足之处，因为不同同工酶在组织分布、细胞内定位、发生发育方面都可能有所差异，临床可利用这些差异来增加诊断的特异性。目前不论在诊断肿瘤，还是诊断心脏、肝等疾病上都找到一些较总酶活性测定特异性、灵敏度高的同工酶测定项目，同工酶正逐步成为酶学中一个重要分支。

　　80年代发现某些同工酶从组织进入体液后，进一步变化分为数个不同类型即所谓同工酶的亚型（isoform）。CK-MB的亚型MB₁、MB₂，CK-MM亚型MM₁、MM₂和MM₃在AMI的诊断和溶栓疗效判断上都优于总酶和同工酶。

　　同工酶是一个复杂的生物现象，至今在分类、概念上尚有一些问题有待研究澄清。从临床诊断角度可将同工酶理解为一个包括有多种能催化相同生化反应的酶族，在这族中虽然不同酶都催化同一反应，但在理化性质上有差异，如它们对底物的亲和性、特异性不同，对抑制剂出现不同的反应，所带电荷、对热耐受性有差异等等。生化学者根据这些差异用各种物理、化学方法将同工酶分离测定，从本质上说这些差异与酶蛋白结构有关，或者是构成酶蛋白的氨基酸在组成或排列次序上出现差异，或者由于二级、三级乃至四级结构不同而造成上述不同的理化性质，同时这些结构差异又可引起酶蛋白抗原性的差异。目前正在大力发展这种用免疫方法测同工酶的技术，并取得明显进展。

　　同工酶之所以有较高的诊断价值与下面一些因素有关：

　　首先是某些同工酶有明显的组织分布差异，以目前临床应用最多的CK和LD同工酶而言，CK大量存在于三种肌肉组织中，单独总CK升高很难判断。CK升高的组织来源为：骨骼肌中主要为CK-MM，平滑肌中为CK-BB，心肌中虽然大多数仍是CK-MM，但却含有14％-40％的其它两种肌组织中没有或仅含少量的CK-MB，这样只要能测CK同工酶，根据同工酶变化，不难判断出释放CK的器官或组织。

　　LD虽然几乎存在于全身各种细胞中，但其五种同工酶在体内分布情况并不相同。如LD₁主要存在于心肌和红细胞中，LD₅则主要存在于肝脏和骨骼肌中，正常血清中同工酶分布为LD₂＞LD₁＞LD₃＞LD₄＞LD₅，这样虽然心脏和肝的多种疾病都能引起总LD升高，但对血清LD同工酶影响却大不相同。如AMI时，LD₁明显增高以致LD₁＞LD₂，肝病时将出现LD₅＞LD₄，AMI患者在LD₁＞LD₂基础上，又同时出现LD₅＞LD₄，可怀疑是否有右心衰竭，引起肝淤血。有些酶的同工酶与上述情况不同，只是细胞内定位不同，临床上有诊断意义的主要是线粒体同工酶，线粒体中有一些酶在结构和性质上往往与细胞质中同工酶有明显差异，临床应用较多的是线粒体AST。轻度病变时，由于线粒体有两层致密的膜，此同工酶很难进入血清，但在细胞坏死病变时，血清中线粒体同工酶常明显升高。近年来发现ALT也存在着两种同工酶，肝脏疾病时ALT经常升高，ALT同工酶测定应该对肝病预后判断有一定价值。

　　在胚胎期，和器官的发生发育一样，这一时期酶带有早期种族进化的痕迹，与出生后人体的酶往往有差异。当人得肿瘤后，肿瘤细胞可以出现返祖现象，有可能出现胚胎期同工酶，测定这类同工酶有助于诊断肿瘤，例如胚胎期CK主要为CK-BB，约有10％恶性肿瘤患者血清可查出CK-BB，又如一些肿瘤患者血中可查到胎盘性ALP等等。

　　总之，随着科学技术的发展，测定项目的增加，测定方法的简化，同工酶测定将在诊断疾病、判断疗效和预后方面起着愈来愈大的作用。