蛋白质组学在植物科学研究中的应用(2)

        Shen等(2003年)应用蛋白质组学方法研究水稻叶鞘伤害反应相关蛋白，首次揭示了水稻叶鞘伤害信号应答过程中蛋白质的变化。比较伤害前后蛋白质表达谱，发现伤害后至少有10个蛋白被诱导或上调，19个蛋白被抑制或表达量下降。通过N-端或内部氨基酸测序，分析了其中的14个蛋白，鉴定了9个蛋白的功能，其它蛋白由于N-端阻断，无法得到氨基酸序列信息。此外，还通过MALDI-TOF-MS测定了11种蛋白质，并与水稻数据库相吻合。在基因功能被确认的蛋白质中，表达量下降的蛋白有2个钙网蛋白、组蛋白H1和血红蛋白和一种假定的过氧化物酶；表达量增加的蛋白包括胰蛋白酶抑制因子(BBT1)、两种假定的蛋白激酶受体类似物、钙调素相关蛋白、核酮糖-l,5-二磷酸羧化酶／加氧酶小亚基、2个甘露糖结合外源凝集素。其中，4种蛋白质已被证实为与伤害反应直接作用的蛋白质。

        Chang等(2000年)对玉米进行缺氧和低氧胁迫研究，发现低氧处理的效应不仅仅是缺氧胁迫诱导的糖酵解酶的增加。通过质谱法共鉴定了46个蛋白质，均为在植物中首次得到鉴定。

2.2  生物环境因子蛋白质组研究

        植物的生长发育不仅与非生物因子密切相关，还受到生物因子如动物、植物、微生物等的极大影响。例如，当植物受到竞争、动物取食、微生物共生或寄生、病菌侵害时，植物将改变体内蛋白质的表达和酶类的活性等来完成这些信号的感应、传递以及生物学效应的实现。因此，通过对蛋白质的研究有助于人们更好地了解生物之间的相互作用机制。目前关于非生物因子对植物影响的蛋白质组学研究主要集中在植物与根瘤菌以及植物与菌根真菌的共生关系上。

        众所周知，根瘤菌与植物相互识别后，进入植物细胞内变成具有因氮能力的类菌体。类菌体周隙(PS，Peribacteroid  space)是类菌体周膜(Peribacteroid  membrance,PBM)与细菌质膜之间的间隙，是共生体成员之间交换代谢产物的媒介。Saalbach等(2002年)用蛋白质组分析的方法，鉴定了PBM与PS中的蛋白。结果表明PS甚至PBM的制备物中含有大量的类菌体蛋白。有趣的是，除了一些PS/PBM蛋白，还有许多内膜蛋白，包括V-ATPase，BIP和一个完整的COPI-coated  vesicles的膜蛋白存在于PRM中，这证明了PBM是由宿主细胞的内膜系统产生的。Wienkoop和Saalbach(2003年)选取豆科模式植物日本百脉根(Lotus  japonicus)，用蛋白质组学的手段研究PBM的蛋白质组。通过纳米液相色谱分离多肽，然后用串联质谱(MS/MS)进行分析。检索非丰度蛋白数据库和通过串联质谱得到的绿色植物表达序列标签数据库，鉴定了大约94个蛋白，远远多于迄今为止所报道的PBM蛋白的数目。特别是一些膜蛋白得到检测，如糖和硫酸盐转运子、内膜联合蛋白(如GIP结合蛋白)和囊泡受体、信号相关蛋白(如受体激酶、Calmodulin、14-3-3蛋白和病原体应答蛋白包括HIR蛋白)。通过非变性凝胶电泳分析了两个特征蛋白复合物。结果鉴定了PBM中参与特定生理过程的蛋白和结瘤特异表达序列标签数据库(EST)中的PBM蛋白质组。

          Bestel-Corre等(2002年)用双向凝胶电泳和银染分析接种灌木菌根真菌(Glomus  mosseae)或根瘤菌(Sinorhizobiurn  meliloti)的模式植物苜蓿不同时期的根蛋白质组。MALDI-TOF-MS分析胰蛋白酶消化的蛋白质组，在结瘤的根中鉴定到了苜蓿的一个豆血红蛋白。内部测序、四极质谱分析和数据搜寻证明了先前预测的由菌共生体诱发表达的蛋白。

2.3  植物激素蛋白质组学研究

          激素在植物一生中起着重要的调控作用，研究植物激素的信号传导和作用机理是蛋白质组学的重要组成部分之一。

        Moons等(1997年)鉴定了水稻根中3个受ABA诱导的蛋白质，其氨基酸序列测定确定其中2个属于胚胎后期丰富蛋白(LEA)的2组和3组，第三个未知。用ABA处理水稻根并提取其mRNA，构建cDNA文库，然后用由氨基酸序列推导出的寡核苷酸做探针进行筛选，分离到了相关的cDNA，但在cDNA数据库中找不到与之相同的序列。通过在基因组DNA文库中筛选及免疫杂交分析，表明这是一个新的基因家族，编码高度亲水具有双重结构域的蛋白质，并被ABA诱导在不同组织中表达。Rey等(1998年)在马铃薯的叶绿体中发现了一个受干旱诱导的蛋白质，没有已知的蛋白质与之相同。利用N-端序列制备的血清在叶子cDNA表达文库中筛选，分离到了新的具有典型硫氧还蛋白特征的cDNA序列，并被硫氧还蛋白活性的生化实验所证实。

        蛋白质组学技术不仅可鉴定早就已知的典型的受环境胁迫诱导的蛋白质，如LEA蛋白质(Riccardi等，1998年)，脱水素(Dehydrin)(Moons等，1997年)，还鉴定了其它一些蛋白质，如对胁迫引起的损害起保护作用的蛋白酶抑制剂、热激蛋白HSP和与氧化胁迫有关的酶、参与糖酵解、木质素合成的酶等(Costa等，1998年；Riccardi等，1998年；Rey等，1998年；Pruvot等，1996年)。用赤霉素和茉莉酸处理水稻的蛋白质组变化也进行了研究。Shen和Komatsu(2003年)将水稻叶鞘用5μmol·L-1赤霉素处理不同时间后的蛋白经2D-PAGE分离和计算机图像分析，看到33个蛋白发生变化，其中21个蛋白点表达增强，12个蛋白表达减弱，说明赤霉素处理水稻叶鞘起码有30多个基因的产物与之相关。对其中的钙网蛋白(Calreticulin)进行了深入分析，发现它有2个不同等电点(pI)蛋白点，随赤霉素处理时间增加，pI4.0的蛋白点逐渐消失，而pI4.1蛋白点浓度则逐渐增加。由此说明钙网蛋白在赤霉素信号传递调节叶鞘伸长中是一个重要组分(Shen等，2003年)。Rakwal和Komatsu(2000年)用外源茉莉酸(Jasmonic  acid)处理水稻的幼苗组织，通过2D-PAGE分析发现在水稻的茎和叶中诱导了新蛋白质。对蛋白质点进行N-端和内部测序及免疫杂交分析，发现茎中有28kD的蛋白酶抑制剂(BBPIN)和酸性的与病理有关的17kD蛋白质(PR-1)。免疫杂交分析表明茉莉酸处理后这些蛋白质的表达具有组织特异性和发育阶段特异性，说明外源茉莉酸处理可以引起与植物自我防御机制有关的基因在茎、叶组织中的特异性表达。   (责任编辑：泉水)

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