Ca++离子分析系统

系统介绍

本公司推出的功能强大的离子分析系统，是专业进行Fura-2、Fura-3、SBFI、PBFI BCECF、Indo-1等指示剂型的胞内离子浓度测量。系统配有高速、高灵敏度冷CCD，激发光源，专业滤光片组、分光器构成的比率荧光定量分析系统，具有实时测定及分析胞内离子浓度、Ratio、PH值的时间变化曲线等，是生命科学研究中的又一有力工具。

系统配置

l        高速高灵敏度数字冷CCD

l        生命科学图像分析系统

l        超高速激发光波长切换器

l        Fura-2专用滤光片组

系统性能：

l        全自动硬件控制，包括：CCD、电动快门、多光谱光源、波长切换装置等控制；

l        具有实时、定量分析的功能；

l        自动生成离子比率或离子浓度时间序列的动态图像、Ratio图像；

l        在选择的细胞或分析区域上，在线分析、自动生成随时间变化的浓度或比率曲线图；

l        可进行离线分析实验图像；

l        可同时分析指定的多个区域，并测定随时间变化的多个参数，如Intensity、平均光密度、ration、浓度等；

l        实验图像可编辑并保存为AVI格式。

系统功能：

钙离子浓度分析               钠离子浓度分析                钾离子浓度分析     

氢离子浓度分析（或PH值）        线粒体生理学研究              单波长Fluo 3测量

应用领域：

离子分析系统可广泛应用在电生理学、细胞生物学、信号通道学、药物学（筛选药物、药效学考查）等方面。

系统详细配置：（略）

测钙原理：

 
Fura-2是一种荧光指示剂可与胞内的游离钙离子特异结合，其游离（未结合）形式的Fura-2比与钙结合形式的Fura-2在更长的波长上被激发，即：结合形式的Fura-2激发波长为340nm，游离形式的Fura-2激发波长为380nm。因此通过检测两个激发波长上荧光强度的比率，就可以确定结合钙的Fura-2与未结合的Fura-2的比例，进而利用Grynkiew icz公式可求游离Ca2+的浓度。

Grynkiew icz公式：

〔Ca2+〕i＝Kd×β（R-Rmin）×（Rmax-R）

其中，Kd为Fura-2和Ca2+结合的平衡解离常数

β是胞内零钙和饱和钙时在380nm的荧光强度比值

R是Ratio比值，Rmin是零钙时Ratio值，Rmax

是饱和钙时的Ratio值。

Fura-2 Ratio法可用于测定组织块、器官、人工培养的单层贴壁细胞、血小板等胞内的游离钙。以下以人工培养的单层贴壁细胞为例介绍实验方法：此检测方法定量，具有快速，灵敏等优点。

测钙样品准备：

材料与方法

试剂：

1.       DMSO 溶液：配置 10 ml 的含 20％ F127 的DMSO母液。

2.       Fura-2/AM溶液：使用含20％F127 的DMSO 溶液溶解成 1 mM 的母液。如：使用 1 ml 20％ F127 的DMSO 溶液溶解 1 mg Fura-2 AM。分装 Fura-2 AM （1 mM 的 stock solution）成 1 ul 一管，储存于－70度冰箱，可以使用1年以上。此试剂购自molecular Probe公司。

3.       K2H2EGTA，K-MOPS，KCI，CaCl2，二甲基亚砜 （dimethylsulfoxide，DMSO），多聚赖氨酸，Tris等均购自sigama公司。Pluronic F-127（表面活性剂有助于负载染料进入细胞），牛血清蛋白（albumin bovine，BSA，电泳纯）（与Pluronic F-127的功效类似）等试剂可购自Amresco公司。此外，上海生工、Invitragon（molecular Probe的代理、大连宝生等试剂公司均可提供相应试剂。

4.       配制校正Kd值的缓冲溶液：

a. 1mM CaCl2溶液

b. 1mM EGTA溶液

c. MOPS缓冲液：100mM KCl，100mM KMOPS。

d. 0.1mM CaCl2：取10体积的1mM CaCl2，加入90体积的MOPS缓冲液，混匀。

e. 制备饱和钙溶液：取10ml 1mM的EGTA溶液，然后缓慢的加入0.1mM CaCl2，边加CaCl2边测PH值，会发现PH值降低，但加CaCl2到一定的体积后PH值稳定不再降低，记下此时所需的CaCl2体积V（一般情况下，不超过5ml）。

 注：以上试剂的浓度较低，可先配制较高浓度的母液，稀释到所需的浓度。

5.       校正Kd的Ca-EGTA溶液

溶液A（零钙溶液）：100mM KCI，10mM K-MOPS，10mM K2H2EGTA，然后用KOH溶液调其PH值到7.2。配20ml溶液A，然后分装成两份，每份10ml。

溶液B（高钙饱和溶液）：此溶液的制备依据e 饱和钙液的制备方法。

取10ml的溶液A，缓慢加入V ml 1mM的CaCl2（V是制d 饱和钙液时的CaCl2体积数），然后KOH调节PH值到7.2。

注：溶液A、溶液B，都可从试剂公司，如Invitragen公司购买molecular probe fura-2专用校正试剂盒，使用非常方便。

   制备梯度标准Ca-EGTA溶液：溶液A和溶液B按各种比例混合（0-100％）。见表1。          

表1 制备标准Ca-EGTA溶液

溶液序号
 CaEGTA
 〔Ca2+〕free
 溶液A
 溶液B
 
0
 0.00 mM
 0   uM
 2.00 ml
 0.00 ml
 
1
 1.00 mM
 0.017uM
 1.8  ml
 0.2 ml
 
2
 2.00 mM
 0.038uM
 1.778 ml
 0.222 ml
 
3
 3.00 mM
 0.065uM
 1.750 ml
 0.250 ml
 
4
 4.00 mM
 0.1  uM
 1.714 ml
 0.286 ml
 
5
 5.00 mM
 0.15 uM
 1.667 ml
 0.333 ml
 
6
 6.00 mM
 0.225uM
 1.600 ml
 0.40 ml
 
7
 7.00 mM
 0.351uM
 1.500 ml
 0.50 ml
 
8
 8.00 mM
 0.602uM
 1.333 ml
 0.667 ml
 
9
 9.00 mM
 1.35 uM
 1.00 ml
 1.00 ml
 
10
 10.00mM
 39  uM
 0.00 ml
 2.00
 

并且使最终的0、1、2……10溶液均含有Fura-2/AM，终浓度均为2ug/mL，PH 7.2。

6.       负载溶液配制：

试剂储存液A：用无水的DMSO配置3mmol/L的fura-2/AM（fura-2/AM浓度与细胞有关，其值在1-10mmol/L之间）溶液。

储存液B液：10％（W/V）的pluronic F-127

负载溶液I（mmol/L）：130 NaCl, 3.5 KCl, 1.25 NaH2PO4, 1.5 MgSO4, 2.0 CaCl2, 24 NaHCO3, 10 葡萄糖，pH 值调至7.2。

储存液C液：用负载溶液I配制20mg/ml的BSA组分溶液。

负载溶液II：

按比例混合A、B、C液，其最终比例为A：B：C＝10：15：975

6. 封片液（缓冲甘油）： 取1份pH 9.5 的0.5 mol/L碳酸缓冲液（0.5 mol/L Na2CO3 : 0.5 mol/L NaHCO3，1 : 3，v/v）与9份甘油（试剂级，无荧光）经搅拌器彻底混合后，4℃冰箱保存备用。

7.       超纯水（如Milli-Q 超纯水，其电导率不小于18M欧姆）

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实验材料准备：

将活化后的细胞接种到培养瓶中，置于CO2培养箱中培养（37℃、5％CO2），隔日更换培养基。待细胞铺满培养瓶底时，用0.25％的胰蛋白酶消化，消化完全后加入终止液终止消化，用吸管吹打均匀，接种入培养板中。培养24h后可用于测定胞内钙离子浓度。

实验步骤：

一、校正Kd值

Kd值是荧光信号和离子强度转换的很关键的参数，其值与温度、PH、离子强度等密切相关。常用的校正方法主要包括：体外校正法和体内校正法。体内校正法又可分为负载法、微注射法、细胞膜穿孔法、离子电渗法和电迁移法等等，其中负载法较常用。可按试验需求选用合适的校正方法。

1.       体外校正Kd值

1.       按表1的制备方法制备一系列的钙标准溶液，然后分别取5ul的溶液0、1、2、3……10

滴到培养皿底部，盖上18×18的盖波片。

注：培养皿经过特殊处理（底部带有特殊的盖玻片小室）、盖玻片需清洗彻底、凉干，消除污染物所带来的背景荧光。

2. 在显微镜下分别观察编号0、1、2、3…10的培养皿，分别在340nm、380nm激发，510n发射成 像的F340、F380以及相应的Ratio值。      &bsp;&;  &bsp;  &sp; 

3. 根据已知的钙离子浓度和对应的Ratio值作曲线，然后以log〔Ca2+〕为X轴，log（R-R0）/log（Rmax-R）为Y轴，作标准曲线。标准曲线在X轴的截距是 – logKd值，从而可求出校正后的Kd值。

注：为便于观察（如调焦）、保持盖玻片和载玻片的间隙，可在钙标准溶液中加直径15um的微球体悬浮物，密度达16000/ml（如购买fura-2校正试剂盒可付送微球体悬浮物）。

注：Kd与环境因子，如温度、PH、离子强度、染料与蛋白间的相互作用等因素相关，因此对系统进行Kd校准很关键。

2. 胞内校正Kd值（采用负载法）

1. 按表1制备一系列的钙标准负载溶液0、1、2、3、……10。其中，溶液A和溶液B均是采用负载溶液配制（注：采用高钙的校正浓度最高不超过2mM，所有溶液的Fura-2/AM的终浓度均为2ug/ml）。

2. 取贴壁生长的细胞培养皿11个，依次编号0、1、2、3、……10，并将培养皿的培养液弃去，分别用Ionomycin或者4-bromo-A23187（10um处理浓度，目的：破细胞膜使胞外的钙离子自由进入胞内），然后负载溶液I 轻轻漂洗3次。生长面朝上，在上面分别滴加约0.5-1 ml的负载溶液II（含有Fura-2/ AM染液）。

3. 室温孵育30分钟左右，间或轻轻晃动几次。

4. 孵育完毕后，用负载溶液I 轻轻漂洗3遍，以除去胞外残余的Fura-2/AM。

5. 制片，待检。利用显微镜Ca2+比率成像系统，检测在340nm、380nm激发的荧光强度值如F340、F380和对应的Ratio值。

6.       根据已知的标准钙离子浓度和对应的Ratio值作曲线，然后以log〔Ca2+〕为X轴，log（R-R0）/log（Rmax-R）为Y轴，作标准曲线。标准曲线在X轴的截距是– logKd值，从而可求出校正后的Kd值。

7.     体内校正Kd法，可同时校正Rmin、Rmax和β值。其中，零钙：可测得F380和Rmin；高钙：测得对应的F380和Rmax，从而可以求出β值。

注1：荧光显微镜下观察到负载后的细胞呈绿色，则表明负载成功，即荧光染料进入细胞。

当荧光标记的信号较低时，细胞内表现为紫色；当荧光信号增加时，胞内颜色由亮蓝色-黄色-红色。

注2：将指示剂导入细胞的方式有几种：（1）用微注射法将探针直接注入细胞内，适合于较大的细胞，限制比较多，而且容易产生损伤；（2）用荧光探针的酯化衍生物和细胞共同孵育法；（3）离子电渗法和电迁移法（主要通过电场作用影响细胞膜的渗透性，适合于带电荷的染料）。

其中（2）法简单、方便较广泛采用。

但是，也有研究发现Fura-2的酯化形式会大量沉积在细胞的分泌颗粒中被排到胞外，引起荧光的损失。