第二节 限制性内切核酸酶与连接酶 

一.限制性内切核酸酶的类型

　　限制性内切核酸酶(restriction endonuclease)常简称为限制酶(restriction enzyme)，是一类能识别双链DNA分子中特异核苷酸序列并由此切割DNA双链结构的水解酶。
　　这些限制酶有着共同的特性，如它们只降解双链DNA分子，不切单链DNA；各种酶有其特定的核苷酸序列识别特异性；酶的活性需要Mg2+离子来激活等等。但不同的酶也有着许多差别，根据它们自身的结构。切割位点和识别序列间的距离不同。使酶激活所需要的辅助因子的差异以及与甲基化作用的关系等，可将限制酶分为I、Ⅱ和 Ⅲ型。

二.Ⅱ型限制要酶的基本性质

　　3种类型的限制酶中，Ⅱ型酶的相对分子质量范围是2.0×104～1.0×105。它们的核酸内切酶活性和甲基化作用活性是分开的，且只需要Mg2+来激活，并不需要ATP辅助因子；在识别序列和切割位点上，也有其特异性，因而Ⅱ型酶是DNA操作的重要工具酶。通常说的限制酶就是指的Ⅱ型酶。限制酶的反应温度一般为37℃。Ⅱ型限制酶有 3个基本特性：一是在 DNA双链分子上有特异性识别并易切割的序列部位，使被切割的DNA分子形成单链的断裂；二是在DNA分子上两个单链断裂的部位通常不是彼此直接相对的；第三，断裂结果所形成的DNA片断常具有互补的单链延伸末端。
　　一般，Ⅱ型酸能识别由4—6个(或7个)核苷酸所组成的特定序列，这类序列常通称为限制酶的识别序列。由于限制酶是从它们的识别序列内来切割DNA分子，所以识别序列又称为限制酶的切割位点或靶序列。大多数Ⅱ型酶切割位点的一个显著特点是它们具有双重旋转对称的结构或称回文序列(palindrome)。
　　切割片段末端的特点：一种是形成粘性末端，它们能够通过互补碱基间的配对重新环化。另一种是形成具有平末端的DNA片段，这种片段则不易于环化。
　　

　　虽然不同限制酶识别不同靶序列，但也有一些来源不同的限制酶识别同样的靶序列，这类酶就特称为同裂酶或同切点酶(isoschizomer)，它们发生同样的切割，产生的粘性末端却不一定相同。与同裂酶相对应的一类限制酶称为同尾酶(isocaudamer)，它们来源各异，识别的靶序列也各不相同，但都产生相同的粘性末端。它们产生的粘性末端可以彼此连接起来，然而应注意的是它们重组后所形成的序列结构却不能再被原来的任何一种同尾酶所识别。

三.DNA连接酶及其连接作用

　　DNA连接酶(ligase)是一种能够催化DNA中相邻的3’－OH和5’－磷酸基末端之间形成磷酸二酯键并把两段DNA拼接起来的核酸酶。它最早发现于1957年，是从T4噬菌体中提取的，它是体外构建重组DNA分子必不可少的工具酶。同限制性内切酶一样，连接酶的发现和应用对基因工程的创立和发展有着举足轻重的意义。 
　　DNA连接酶能够封闭DNA双链，并不能连接两条单链DNA分子，而被连接的DNA链必须是双螺旋DNA分子的一部分。事实上，DNA连接酶所封闭的是双螺旋DNA骨架上的切口(nike)而不能封闭制缺口(gap)；这也就是指只有当3’－OH和5’－P彼此相邻，而它们又是各自位于互补碱基配对的两个脱氧核苷酸的末端时，DNA连接酶才以能把它们连接成磷酸二酯键。连接过程的这种形式对于正常DNA的合成、损伤DNA的修复和遗传重组中DNA的拼接都是十分必要的。连接酶催化反应的最适温度是37℃。
　　 连接酶把两个具有粘性末端的DNA分子连接在一起的方式称作“粘接”，而使平末端的双链DNA分子彼此连接的方式则称为“端接”。连接酶也用于连接化学合成的衔接物(linker)，这有助于体外合成人造基因。