第三节 基因工程中的载体

一.分子克隆的载体及其所应具备的基本条件

　　目前所用的载体有细菌的质粒(如大肠杆菌质粒)、噬菌体或病毒，更多的是经过人工改造的一些载体。用于分子克隆的载体都应具备下述条件：
　　① 在细胞内能自主复制，即具有复制原点，可以使所携带的外源DNA在受体细胞内忠实地复制；
　　② 有适宜的限制酶切位点。最好是对多种限制酶有单一切点，且酶切位点不在复制原点内。 　　③具备对重组体易于检测的选择性遗传标记。
　　除上述的基本条件外，根据实验的需要，人们还常希望载体具有其他的各种特征。如携带外源DNA的幅度较宽，具备可促进外源DNA高水平表达的调控区；为保证安全，载体在特定宿主细胞外不能生存，以及某些特殊的筛选指标等等。
根据DNA分子克隆的目的，载体可分为：
　　克隆载体：是指以繁殖DNA片段为目的一类载体。这类载体一般较小，其复制不是处于寄主的严谨控制下，因此特定的DNA序列可以通过克隆技术大量制造，如pBR322
　　穿梭载体：是指那些既能在真核细胞中繁殖又能在原核细胞中繁殖的载体。这类载体必须既有细菌的复制原点或质粒的复制原点，又含有真核生物的复制原点，还具备酶切位点和合适的筛选指标。它用来转化细菌，又可以用于转化真核细胞。
　　表达载体：是用于使克隆的外源基因在寄主细胞内表达的一类载体。它要有很强的能为寄主RNA聚合酶识别的启动子，有使RNA聚合酶只转录克隆的基因而不能转录无关序列的强终止子；其次是启动子还应是受控制的即只在诱导时才进行转录，以保证转录效率，并防止给细胞造成不利影响。

二.常用的载体

(一) 质粒载体 
　　质粒是细菌细胞中独立于细菌“染色体”之外能自主复制的遗传单位。质粒DNA分子在宿主细胞内可以持续稳定地游离于染色体外，但在一定条件下又能可逆地整合到宿主染色体上并随之复制，通过细胞分裂传递到后代。质粒DNA是共价闭合的环状双链分子，常带有一些特殊的基因，如致育基因，合成抗菌素的基因、抵抗抗生素的抗性基因以及降解复杂有机化合物的基因等，从而赋予寄主细菌一些额外的特性。
　　质粒具有不相容性 (incompatibility)，就是指在没有选择压力的情况下，两种亲缘关系密切的不同质粒不能共存于同一宿主细胞内。在细胞增殖的过程中必定有一种会被逐渐排斥掉。这样的两种质粒称为不亲和质粒。正是基于质粒的不相容性，分子克隆可在只带一种质粒的细菌中提取单一的质粒DNA供作载体进行 DNA 重组。
(二)噬菌体载体
1. λ噬菌体载体 
　　λ噬菌体是迄今为止研究得最为详尽的一种大肠杆菌双链DNA噬菌体。它的DNA分子两端各有由12个核苷酸组成的粘性末端，两者互补可形成COS位点(cohesive end site)。

2. 柯斯质粒载体 
　　柯斯质粒(cosmid)是人工构建的带有粘性末端cos的一类质粒，其主要组成有质粒的复制起始区和抗药标记、一种或多种限制酶的单一切点以及 λDNA的COS区小片段(约20至数百个碱基对)。因而这类质粒兼具λ噬菌体和质粒的优越性，又具有高容量的克隆能力，容纳外源DNA的长度可达 45 kb左右。
应用柯斯质粒为载体，在大肠杆菌细胞中克隆基因组大片段DNA的技术称为柯斯克隆(cosmid cloning)。这一技术的优点是，首先由于柯斯载体的前述特性，提高了克隆外源DNA片段的能力，是构建真核生物基因组文库特别有用的克隆载体；其次，以柯斯质粒为载体，所形成的非重组体的克隆其本底常较低。
(三)人工染色体 
　　以噬菌体为基础构建的载体以及cosmid(粘粒)系统只能接纳在一定大小范围内的插人片段，只是一些真核基因过于庞大不能作为单一片段克隆到这些载体中。于是发展出来 P1噬菌体人工染色体 (p1artificial chromosome，PAC)、细菌人工染色体 (bacterial artificial chromosome，BAC)、酵母人工染色体 (yeast artificial chromosome，YAC)等新的克隆技术。其中酵母人工染色体克隆系统已较完善。
　　以酵母作为构建人工染色体的材料，是由于其基因组很小，约为1～14mb，且其中极少内含子，没有重复序列和假基因。其基因行为和表达方式基本上与高等生物类似，如复制、重组、染色体分离等等，因而是研究真核生物分子遗传学的重要实验模型。加之近年对有关酵母染色体的主要组分：着丝粒、自主复制序列 (autonomously replicating sequence，ARS)及端粒的研究又较清楚，并被分离和克隆出来，其功能区已缩小到数百碱基对，这些对研究高等生物染色体的结构与功能也是极为有利的。