首页 | 家园 | 百科 | 下载 | 书库 | 仪器 | 展会 |人才 | 公司 | 网址 | 问答 | 论坛 | 注册 | 通行证登录 | English

生物行

生物行   进展 | 摘要 | 人物 | 医药 | 疾病 | 技术 | 健康 | 能源   生物航   供应 | 求购 | 公司 | 展会 | 要发布
论坛   神经科学 | 神经系统疾病 | 实验技术 | 求职招聘 | 器材试剂 | 文献检索 | 读书笔记 | 考试招生 | 软件使用
当前位置: 主页 > 生物技术 > 基本实验 >

荧光共振能量转移(FRET) 技术

时间:2005-11-26 20:23来源:internet 作者:bioguider 阅读:

基于不同光学平台的荧光共振能量转移(FRET) 技术

[摘 要]: 荧光共振能量转移( FRET)是用于对生物大分子之间相互作用定性、定量检测的一种有效方法。根据所基于的荧光显微镜配置不同而有不同的应用侧重,可在溶液,细胞悬液,多细胞,单细胞,细胞膜,细胞器等不同层次对生物大分子间的相互作用距离,动力学特性等进行研究。本文就基于常规宽场荧光显微镜、全内反射荧光显微镜,连续激光共聚焦显微镜、脉冲多光子激发显微镜等显微技术的FRET方法分别进行了介绍和对比评估。对于实验室应用和配置FRET系统具有参考意义.

 

[关键词]: 荧光共振能量转移,W-FRET,TIRF-FRET,  Confocal- FRET,MP-FRET

 

1介绍

随着生命科学研究的不断深入, 光学显微镜使我们理解了细胞结构和有关功能。但是分子生物学研究已经显示了分子事件,例如信号传导和基因翻译,需要蛋白质的装配成特殊的大分子复合体等。对各种生命现象发生的机制,特别是对细胞内蛋白质间相互作用的研究变得尤为重要。传统的生物物理或生物化学方法例如亲和色谱法或免疫沉淀反应法和近来的酵母双杂交、磷酸化抗体、免疫荧光、放射性标记等方法等,都需要破碎细胞或对细胞造成损伤,无法做到在活细胞生理条件下实时地对细胞内蛋白质-蛋白质间相互作用进行动态研究。

而基于强度的影像技术例如FRET方法(宽场,共聚焦,双光子),使得研究活细胞内的这些相互作用变得容易了(Periasamy, 2001)。新的影像技术,结合开发新的基因编码的荧光基团标记和传感器以及计算机影像采集和分析软件的能力增强,使许多复杂的研究例如蛋白质功能和加工、基因表达和第二信使传递、胞内信号传导等研究成为可能。(Roessel and Brand, 2002).

FRET是通过分子间的电偶极相互作用将供体激发态能量转移到受体激发态的过程,它是一种非辐射跃迁[2 ],发生FRET时,分子间距离小于10nm。如果发生FRET,则供体通路信号将淬灭而受体通路信号将激活或增强(Herman, 1998)。FRET显微技术高度依赖如何快速高效地捕获来自标定分子间相互作用的短暂微弱的荧光信号的能力。由于能量传递发生在1-10nm,一个FRET信号代表了一个显微镜图象中的一个特殊位置。这等效于提供了一个额外的放大倍数,使 FRET超越显微镜的分辨率限制而以分子尺度分辨出供体-受体的平均距离,并能显示出受体-供体的相互作用。
 

2基于不同光学平台的FRET显微技术

 

FRET供体受体配对

广泛用于FRET研究的的供体-受体荧光基团来自自发荧光蛋白GFPs.。选择GFPs作为可工作的FRET对,要仔细考虑其光谱特性:对选定的供体受体配对,它们的激发光谱要足够分离,供体发射光谱与受体激发光谱部分重叠(>30%)以获得足够的能量传递;供体受体发射光谱的合理分隔,以便独立测量每个荧光基团的荧光。

根据生物学应用的不同,有一些FRET对的组合。常用的FRET对荧光基团有:CFP-YFP;CFP-dsRED;BFP-GFP;GFP-dsRED;YFP-dsRED;Cy3-Cy5;Alexa488-Alexa555;Alexa488-Cy3;FITC- Rhodamine (TRITC);YFP-TRITC ;YFP- Cy3。
 

FRET方法配置

FRET方法可以基于不同的光学平台配置,适用面很宽。一般的FRET系统都包含如下配置:

激发光源:稳定的汞灯、氙灯、汞氙复合电弧灯光源;从紫外到红外波段不同波长的激光光源。

中性密度滤光片:用以控制激发光的强度。

滤镜组:为选定的荧光基团组合配置合适的滤镜组,包括激发,发射,二色分光等。需要仔细选择滤镜组合,以削减光谱串色,提高FRET信号的信号噪声比。

检测设备:高灵敏度PMT或冷CCD。 

根据所使用的光学平台配置,可将FRET显微技术分为如下两类:单光子激发和多光子激发。单光子激发类中包括基于常规宽场的(Wide-Field)W-FRET,全内反射TIRF-FRET),共聚焦(confocal)C-FRET。多光子激发中包括双光子和多光子(MP-FRET)。 

2.1 

单光子常规宽场FRET显微术

宽场荧光显微镜是最简单和最广泛应用的荧光光学平台,因此W-FRET也相应地成为应用最为广泛的FRET方法。任何荧光显微镜(倒置或正置)都可配置成宽场FRET显微镜(W-FRET)。将稳定的汞灯、氙灯、汞氙复合电弧灯等光源,通过光栅或滤镜轮来选择合适的激发波长;激发光通过二色分光器照射到样本平面,激发样本中的荧光基团。通过选择与染料蛋白匹配的滤镜组,样本发射出的信号荧光由高速高灵敏度的CCD分时(滤片轮)或同时(分像器)获取供体D、受体A,供体-受体D-A的荧光图象。再经过专门的软件处理,获得FRET结果图象。

W-FRET广泛用于研究细胞间相互作用的量化比较和细胞运动特性的动力学研究、胞内机制、分子运动等,样本中大区域发生的分子间的相互作用。例如,新的荧光基团指示剂可以允许在胞液和细胞器中测量通常是极其局部化的钙信号(Miyawaki et al., 1997);在单个活细胞中无损获得动态蛋白质酪氨酸激酶活性(Ting et al., 2001)。

但宽场照明使整个目标被曝光,贯穿整个样本(焦面和焦外)的样本发射荧光都被高NA物镜收集。这种情况在传统的宽场荧光显微镜中无法避免,对于微弱荧光,例如单分子荧光,焦平面外的杂光会严重降低图象对比度和锐度。一个补偿手段是使用反卷积算法等数字图象处理技术,以部分消除焦外信号。
 

2.2

单光子共聚焦-FRET显微术

和传统的宽场荧光显微镜不同,在共聚焦显微镜中,一个单衍射限制聚焦光斑被高NA物镜投送到样本,者样本发出的荧光可再被物镜收集并聚焦到一个针孔附近,只有来自样本焦平面的光可进入小孔,而焦外光无法进入针孔。信号由高灵敏度的光电倍增管(PMT)探测。激光束逐点扫描样本,可产生二维图象。激光共聚焦显微镜可在2-3秒内产生清晰的去除了焦外光的非常清晰的高信噪比图象(512x512像素)。采集一系列不同Z轴平面的光切片图象,可得到一个样品的三维映射,在Z轴方向的分辨率可达到500nm(40X1.3NA物镜)。而且,共聚焦显微镜提供了改进的横向分辨率,并能对完整的厚的活样本进行直接非侵入的连续光层析成像。由于是扫描激发,可以控制扫描的位置和区域大小,这对于特定位置的分子间的相互作用研究特别有利。例如,为了研究细胞膜上膜蛋白的定位,只需要扫描细胞膜附近的区域。

 

通过选择合适的滤镜组合,C-FRET可在任何激光共聚焦显微镜上实现。

利用某个波长的激光作为激发光源,通过二色分光镜照射样本。选择与染料蛋白匹配的滤镜组,通过高灵敏度的PMT分时或同时获取供体、受体,供体-受体的荧光图象,再经过软件处理,获得FRET结果图象。C-FRET中使用的PMT具有很高的品质:高稳定性、 低噪声、非常大的动态范围(大于1000,000倍)、高灵敏度 、宽光谱响应、快速时间响应 、小物理尺寸。

由于采用激光做点激发,能量密度很大,容易引起光漂白,因此需要使用合适的中性密度滤光片,以降低能量。C-FRET的主要限制是使用了激光做激发光源,而激光的波长选择是有限的,可调谐激光的波长一般在红光或红外波段。因此激发不同荧光基团的可用波长受到了标准激光波长的限制,而不象宽场荧光显微镜可通过光栅或滤光片选用任何可用的激发波长。根据目前的标准激光源,C-FRET适用的荧光基团包括:

CFP-YFP 或 ds-RED, GFP-Rhodamine 或 Cy3, FITC 或 Alexa488-Cy3, Alexa488-Alexa555 ,Cy3-Cy5。

C-FRET滤镜组如下表:

荧光基团
 激发波长 (nm)
 发射滤片(nm)
 
Alexa 488 or GFP
 Argon 488
 515/30 or 535/50
 
Cy3 or Phod-2
 Green HeNe 543
 590/70
 
CFP
 Argon 457
 485/30
 
DsRED1
 HeNe 543
 590/70
 
YFP
 Argon 514
 528/50
 
Cy3 
 Green HeNe 543
 590/70
 
Cy5
 HeNe 633 or HeNe 594
 660LP

 

2.3

单光子全内反射-FRET显微术

在常规宽场或共聚焦显微镜中,照明以沙漏形图案贯穿激发光束的整个路径。这导致沿着激发光束路径的能量吸收,使得发生焦外荧光,而且其它焦面的激发会对样本平面产生光漂白和光毒性作用。这种情况在全内反射和多光子/双光子显微镜中得到改善。

全内反射荧光显微技术是一种特殊的宽场荧光显微技术。当光从光密物质向光疏物质照射,当入射角达到或超过某个临界角度时,将发生全反射,将绝大部分能量反射回光密物质,而小部分能量在交界面上将产生一个隐失场(Evanescent Field),能量集中在厚度从几十至几百nm之间的范围内,且在垂直方向呈指数衰减。只有在该隐失场内的荧光基团才能被激发,而整个背景的其他任何深度的荧光基团都不会被激发,因此获得了极高的信噪比。对于研究膜基底的膜蛋白等。可使用常规宽场FRET的滤镜组。
 

2.4

多光子-FRET显微术

多光子激发显微镜本质上是一种共聚焦显微镜。在传统的单光子共聚焦激光扫描显微镜中,如果使用的荧光染料需要紫外光激发,就涉及到紫外波段的传输光路所有光学元件都需要使用石英等特殊材料特殊设计,重复的紫外光扫描会严重削弱样本的活性等问题。

而双光子激发激光扫描显微镜克服了这个问题。当在荧光基团的某个位置极短的时间内连续到达多个相同波长(λ)的光子,将可能发生多光子(n个)吸收,其效果可等效于吸收一个nλ波长的单光子,一般,n等于2,即发生双光子吸收。发生双光子吸收的概率依赖于两个光子在荧光基团内吸收截面的空间位置重叠和到达时间重叠。双光子激发需要非常高的局部瞬时强度,为得到该强度,激光脉冲峰与基底之比可达106。但如此强的能量只集中在极短的激光光脉冲宽度(1 飞秒= 10- 15秒)内,占空比很小,对生物样本并不会造成很大的伤害。例如使用76MHz重复速率的100飞秒的激光脉冲,单脉冲能量只有纳焦耳量级。利用多光子激发,对原本必须用紫外波长(例如350nm)单光子激发的样本可改用红光波长的双光子(700nm)激发,大大减小了对样本的伤害。而且,多光子激发可以使用调谐激光器,例如可调谐兰宝石激光器,可输出700-1000nm波长的激光。

在MP-FRET实验中,需要选择合适的滤镜组和高灵敏的PMT采集供体和受体图象。需要注意减小能量避免光漂白。

如果供体和受体激发波长未知,需要确定FRET配对的激发波长。对MP-FRET,兰宝石激光被调谐分别用于探测最大和最小的供体和受体信号。最大供体信号和最小受体信号对应的波长,用于收集双表达细胞的FRET信号。例如,在表达了C/EBPD244蛋白的细胞中标定CFP(供体)和YFP(受体),激光波长在700-1000nm间变化。最大的CFP信号和最小的YFP信号在820nm。最小的YFP信号和最小的CFP信号在920nm。所以,激发波长可用820nm,来采集双表达(CFP-YFP-C/EBPD244)细胞的FRET信号。这种选择供体和受体激发波长的方法可适用与任何MP-FRET荧光基团对。由于被选择的供体激发波长也能激发受体,因此该技术需要矫正以去除FRET图象中不希望的荧光信号。(Elangovan et al., 2003).激发供体和受体的激光强度可能不同。但一旦你调整供体激光强度( 例如10%),就固定用于激发供体。对受体激发波长也类似要求。

Filter configurations for multiphoton image acquisition for selected fluorophore pairs.

荧光基团
 激发波长 (nm)
 发射滤片 (nm)
 
Alexa 488
 790
 515/30
 
Cy3
 735
 590/70
 
BFP
 740
 450/80
 
EGFP
 880
 515/30
 
CFP
 820
 485/30
 

 

 

3 FRET 数据处理

发生FRET的一个重要条件是供体发射谱与受体吸收谱有部分重叠。而重叠的结果,FRET信号中总有供体发射光进入受体采集通路(DSBT),以及受体分子被供体激发波长激发(ASBT)。两种干扰信号被称作光谱串色信号。理论上,对于本文介绍的4种FRET方法,SBT是相同的,因此,可以用相同的手段进行处理。除了SBT,受体通路的FRET信号还需要对供体受体的光谱灵敏度的变化进行矫正以及对自发荧光和光学噪声进行矫正。

 

去除FRET信号的光谱串色,需要采集7幅图象。该方法假定使用了3种不同的细胞:双标定细胞(D+A)和单标定供体细胞(D)、单标定受体细胞(A)。所有图象采集都在相同的条件下进行,例如相同的探测器增益,相同的中性密度滤光片等等,以使SBT具有相同特性。由于需要采集3种不同的细胞(D,A,D+A),它们之间各自的像素位置没有可比性。能比较的是与荧光强度匹配的像素。逐点计算像素荧光强度可确立单标定细胞的SBT强度,然后应用这些数据作为矫正系数对双标定细胞进行像素匹配矫正。

 

图象编号
 样本
 激发滤镜和波长
 发射滤镜和波长
 Meaning
 
A
 仅供体
 供体Donor
 供体Donor
 信号只来自供体样本。使用供体激发和供体发射滤镜组。
 
B
 仅供体
 供体Donor
 受体Acceptor
 信号只来自供体样本。使用供体激发和受体发射滤镜组。.
 
C
 仅受体
 供体Donor
 受体Acceptor
 信号只来自受体样本。使用供体激发和受体发射滤镜组。
 
D
 仅受体
 受体Acceptor
 受体Acceptor
 信号只来自受体样本。使用受体激发和受体发射滤镜组。
 
E
 供体和受体
 供体Donor
 供体Donor
 信号来自供体-受体样本。使用供体激发和供体发射滤镜组。
 
F
 供体和受体
 供体Donor
 受体Acceptor
 信号来自供体-受体样本。使用供体激发和受体发射滤镜组。
 
G
 供体和受体
 受体Acceptor
 受体Acceptor
 信号来自供体-受体样本。使用受体激发和受体发射滤镜组。
 

 

 

4 讨论

本文介绍的4种基于不同光学平台的FRET技术。W-FRET显微术是最简单和最广泛应用的技术,适用于大区域发生的蛋白质相互作用。但由于焦平面外的干扰信号,会严重降低图象质量。TIRF-FRET显微术可以极大的降低背景光,是一种近乎理想的宽场显微技术。但由于要发生全内反射,要求使用高倍物镜(60X/100X),实际的视野对大区域发生的蛋白质相互作用就小了。宽场FRET可用CCD成像,不需要扫描,可同时获得所有像素的信息,时间分辨率高。TIRF-FRET非常适合研究细胞基底接触区域内的蛋白质相互作用,如细胞膜内蛋白质的动力学过程,细胞囊泡释放,基底附近的细胞骨架,细胞运动等。

相对常规宽场FRET,C-FRET和MP-FRET则由于其共聚焦特性,大大削减了焦外前景背景光的可大大提升图象质量。 MP-FRET可以被认为是C-FRET的增强。在C-FRET中,光漂白会在焦外平面发生。而在MP-FRET中,光漂白被大大削减,并且激光照明只发生在焦平面上。重复在样本上的扫描,特别是紫外光,会导致快速的光致异构化和高背景自发荧光。而MP-FRET消除了这些问题,提供了较好的红外波长的穿透深度,因而延长了细胞的活性。C-FRET在紫外激发波段需要特殊的紫外光路用于紫外激发探针。而 MP-FRET使用常规显微镜光路即可。在C-FRET,发射波长接近与激发波长(约 50-200nm),而在MP-FRET中,荧光发射波长远小于激发波长。

 

5 结语

生物、影像、光谱学结合在一起,提供了基础研究和临床应用的有力工具。FRET技术和荧光试剂例如GFP,被广泛用为探针,作为基因活性、细胞成分、代谢或信号途径的标记;如果应用在在多光谱影像工具中,其作用更加强大和灵活。光谱影像可以容易和精确的探测与癌症和基因异常有关的染色体重排,这改善了染色体分析和基因类型方法。光学活组织检查技术使用内源或外源的发光基团或荧光基团以区分正常组织中的肿瘤和发育异常。组织FRET影像的潜在应用已经萌芽。随着近来荧光探针、仪器、方法的进步, FRET将给生命科学研究带来一场革命。
(责任编辑:泉水)
------分隔线----------------------------
发表评论
请自觉遵守互联网相关的政策法规,严禁发布色情、暴力、反动的言论。
评价:
表情:
用户名: 验证码:点击我更换图片
推荐内容