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分子生物学笔记(3)

时间:2005-12-30 20:56来源:Internet 作者:bioguider 阅读:


第三节?细胞膜受体介导的信号转导


一、受体的分类
质膜受体和胞内受体(胞浆或核受体,如类固醇激素受体)
膜受体的分类:
(一)G蛋白耦联受体家族
又称为七次胯膜受体家族,特点是具有七段跨膜的α螺旋结构,本身无酶活性,胞浆侧肽链上有磷酸化位点,受体功能受磷酸化调节。成员;肾上腺素受体、多巴受体、视紫红蛋白等。
(二)酪氨酸激酶受体家族
受体本身胞浆侧有蛋白酪氨酸激酶活性,并且胞浆侧肽链上有自身磷酸化位点,配基结合后受体形成二聚体,二聚体中每个亚基可以磷酸化对应的另一亚基,从而启动信号转导。
这类受体主要包括多数生长因子受体(如IGF,EGF,PDGF,NGF,SCF,HGF等生长因子的受体),除胰岛素受体外,这类受体均由一条肽链组成.
(三)细胞因子受体家族
这类受体本身无TPK活性,但其胞浆侧近膜部分有非受体酪氨酸蛋白激酶的结合位点,在配基与受体结合后,受体发生二聚化或寡聚化,并激活Jak族蛋白酪氨酸激酶.
此类受体包括细胞因子受体以及生长激素、促乳素等受体.
细胞因子(cytokine):是淋巴细胞和造血细胞产生的一大类对细胞生长和分化有调节作用的蛋白因子。包括干扰素(IFN)、白细胞介素(IL)、白血病抑制因子(LIF)、抑癌素M等 (但IL-8R为G蛋白藕联受体)
(四)离子通道受体
与配基结合后构成离子通道,主要存在于神经突触,如乙酰胆碱(ACH),5-HT受体等。
二、G蛋白介导的信号转导?。
G蛋白藕联受体的信号转导途径由三部分组成:
①细胞膜受体;②G蛋白③效应物(effector),其中G蛋白将受体与效应物藕联.
G-蛋白(G-protein)是一种鸟苷酸结合蛋白,是由α、β和γ三个亚基组成的异三聚体, 多,β和γ亚基总是紧密结合在一起作为一个功能单位Gβγ
Gα亚基可分为Gs,Go,Gi,Gq等,其活性可被霍乱毒素(CT)或百日咳毒素(PT)修饰。
G-蛋白介导的信号转导的机制:G-蛋白循环。
G-pr的效应物:离子通道、腺苷酸环化酶、磷脂酶C、磷脂酶A2等
三、RAS-MAPK信号转导途径
1、途径中的信号分子
Ras:具鸟苷酸结合活性的一种胞浆蛋白(与G-蛋白不同)
Ras活性与其结合的鸟苷酸有关。

鸟苷酸交换因子(SOS)
Ras?GDP?Ras?GTP
(失活)?GTP酶激活蛋白(GAP)?(激活)

接头蛋白:生长因子受体结合蛋白Grb2,通过其SH2结构域与Tyr被磷酸化的受体结合,同时通过其SH3域与具有pro富集区的SOS结合,并通过SOS活化Ras蛋白.
2、Ras-MAPK途径:

生长因子→生长因子受体(具酪氨酸激酶活性)→含有SH2结构域的接头蛋白(如Grb2)→鸟苷酸交换因子SOS→Ras-GTP→Rafl→MAPKK(MEK)→MAPK→转录因子→调节基因表达。
3.Ras-MAPK途径的调节
①Ras-MAPK途径中信号转导分子的突变(如Ras)和表达量的改变.
②其他信号转导途径的影响
cAMP-PKA:抑制Raf-1;?PKC:活化Raf~l,
四、Jak-stat途径:
STAT:信号转导物与转录激活剂(signal transducer and activators of transcription)
至少6种,分子量84-113KD,含一个SH2结构域(羧端),一个SH3样结构域,并合有DNA结合域,Stat的激活依赖通过磷酸化形成二聚体.

[NextPage]

 

Jak-Stat途径:
细胞因子→受体(二聚体化)→Jak→Stat→Stat二聚体(活化)→易位至核,影响转录.
拓扑异构体的互变由拓扑异构酶催化。发生一条链或两条链的断开和连接。
拓扑异构体:具有完全相同的碱基顺序,但L 值不同的超螺旋。分为I, II 型
两种拓扑异构酶:Topoisomerase I , II
第三节 DNA双螺旋的呼吸作用
甲醛的变性实验
呼吸作用的定义
碱基对的稳定性
生物学作用
第四节 DNA的变性复性和分子杂交
一、变性(溶解)
在某些物理化学因子的作用下,DNA 双链间的氢键断裂,双链解离形成单链。
㈠性质变化
增色效应;黏度降低;沉
降速度增加。
㈡因素
⑴温度:温度升高引起的
DNA 变性称热变性。加热
使氢键断裂。
可用热变性曲线描述热变
性过程。见下图
融点Tm:50%DNA 分子解链时的温度。
融点与DNA 分子中的GC 有关,随(G+C)%
的含量呈线性增加
⑵化学:甲酰胺破坏氢键
二、复性
去除变性条件后,单链DNA 在适当条件下重新形成双链,回复到原有的物理和生物学特性。
㈠复性动力学
复性过程是两条单链DNA 碰撞形成双链DNA 的过程,是双分子反应。服从二级反应动力
学规律。
控制复性反应的两个参数是C0 和t
Rate of reaction
The reaction follows the second order equation
C is the concerntration of DNA that is single-stranded at time t
k is a reassociation rate constant.
Progress of reaction
Integrate the rate equation between the limits;
Initial concerntration of DNA=C0 at time t=0;
Concentration remaining single stranded=C after time t
Critical parameter is C0t1/2
When the reaction is half complete at the time t=1/2
Therefore C0t1/2=1/k.
复性反应进行到50% 时的C0 .t 为C0 t1/2
C0t 曲线:用已经复性的DNA 浓度,即1-C/C0
对C0t 的对数作图。如右图所示.
C0t 值的意义:C0 t1/2 值可以用来表示反应体系
中DNA 的总长度(单拷贝)。这种总长度称为
DNA 的复杂性。通过测定复性动力学可以预测
基因组的大小。
真核基因组DNA 的复性动力学:
第1 是快复性动力学组分,高度重复序列。
第2 是中复性动力学组分,中度重复序列。
第3 是慢复性动力学组分,单拷贝序列。
X:DNA 的复杂性
C0t 曲线特征:⑴原核生物每种图形的现状
大致相同;⑵重复序列多,复性快。
曲线意义:求DNA 的复杂度。
三、分子杂交
原理:基于DNA 的变性与复性的特性。双链DNA 加热以后,变成单链,在去除变性条件
后,在一定的条件下,具有互补顺序的DNA
能再形成双链。
探针:一种标记的一段DNA 或RNA,与待
测基因序列的DNA 或RNA 互补
分子杂交技术的种类:⑴固相杂交(待测核
酸固相化);⑵Southern blot ,待测核酸为DNA;⑶Northern blot ,待测核酸为RNA。
液相原位杂交示意图:⑴Dots hybridization,点状杂交,待测核酸为DNA 或RNA;⑵Colony
or plaque hybridization, 菌落或噬菌班杂交,待测核酸为DNA。⑶Tissue hybridization ,组织
原位杂交,检测mRNA 表达和定位。
研究基因的定位,拷贝数,测序。
菌落原位杂交:
基因文库:染色体DNA 文库,cDNA 文库。
第三章基因和基因组
一、原核生物基因组
⒈特征
⑵通常含有质粒;
⑶操纵子结构;
⑷顺反子;
⑴只有一个染色体;
⑸有SD 序列;
⑹基因重叠;
⑺一般没有内含子;
⑻只有一个复制起始位点;
⑼以RNA 为产物的基因往
往是多拷贝的,蛋白质基因
单拷贝。⒉⑴фX174 ;⑵λ噬菌体
1.染色体、核小体结构
二、真核生物基因组
⑴染色体功能实现三要素:①着丝点;②端粒;③复制起始点。
⑵基因组大小和C 值矛盾
C 值:单倍体基因的全部DNA 含量。
C 值矛盾:①与预期相比,C 值明显过大;②同一物种,C 值相差很大。
⑶基因组的基因数目(下表:不同生物的基因数目)。
种类基因组大小(bp) 基因数目
支原体 1.0×106 750
噬菌体T4 1.6×105 200
大肠杆菌 4.2×106 2350
酵母 1.3×107 6100
果蝇 1.4×108 8750
人 3.3×109 65000-80000
⑷真核生物基因组序列特征:
具有多个复制起始位点;编码序列仅占一小部
分(3%) ,大部分为非编码序列。
单拷贝序列;轻度重复序列;
中度重复序列;高度重复序列。
不同物种中,重复序列/非重复序列的比例相差很大,原核基本不重复。
⑸真核生物的重复序列
①基因家族:Ⅰ.珠蛋白;Ⅱ.rDNA;Ⅲ.tDNA;Ⅳ.组蛋白基因。
rRNA 基因:酵母:140 次;果蝇:130~250 次;人类:300 次。
10 组蛋白基因家族:
左图1 为组蛋白
基因家族,箭头
←→表示转录
方向,右侧数字
表示基因组重
复次数。
左图2 为真核生
物基因组中不同
的多基因家族。
②Alu 的重复序列:Ⅰ.AG↓CT;Ⅱ.散布;Ⅲ.Alu 序列;Ⅳ.约90% 相同。
③卫星DNA
Ⅰ.隐蔽卫星DNA
Ⅱ.小卫星DNA
Ⅲ.微卫星DNA
A.单拷贝序列特征
a.含有内含子
内含子(intron)
外显子(exon)
内含子检测:
限制性内切酶图谱
DNA 的杂交内含子GT/AG 规则:
内含子与外显子连接处的序列特异: 内含子5’端为GT,3 ’端为AG, GT/AG 规则.
--------GT--------AG--------
外显子内含子外显子
B.存在不同的转录单位
a.简单转录单位
转录单位的基本组成:
b.复杂转录单位
转录方式不同,拼接方式不同.
三、基因定位
遗传图:基因在染色体上的位
置。
经典方法:
⒈遗传交换定位
⒉接合定位
⒊染色体爬行法
基因鉴定的方法:外显子特征
⒈与RNA 后cDNA 杂交;
⒉Zoo-blot 不同物种杂交;
⒊外显子捕捉;
⒋CG 岛鉴定;
⒌扣除杂交。

(责任编辑:泉水)

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