mRNA的分离纯化

mRNA的分离纯化

离心管中秤取1克Oligo-dT纤维素，加入1×上样缓冲液 10 ml悬浮。
根据总RNA量装填Oligo-dT 纤维素柱（10mg 总RNA/1 ml 床体积），加10倍体积的Mili-Q 水洗柱,然后用10倍体积的0.1 mol/L NaOH洗柱, 再用10倍体积的Milli-Q 水洗柱，直至流出液pH=7, 再用10倍体积的1×洗脱缓冲液洗柱, 最后用10倍体积的1×上样缓冲液洗柱，以使层析柱平衡。
在1×上样缓冲液正好流至柱床表面时，将总RNA样品在68℃变性3min，然后迅速插入冰水浴内, 加入等体积 2×上样缓冲液并混匀，随后，将总RNA溶液上样于层析柱，收集流出液，再次变性后上样挂柱，收集的流出液-20℃冷冻暂时保存，待mRNA检测完后丢弃。在所有液体流干后，用10倍体积的1×上样缓冲液洗柱，直至OD260值接近或为零。
在洗柱完毕后，加3倍柱床体积的1×洗脱缓冲液洗脱mRNA，在1.5 ml离心管中收集流出液。
收集流出液，取适量样品检测OD260，其余加2.5倍体积的无水乙醇，0.1体积的3 mol/L NaAc(pH 5.2),混匀后-20℃沉淀2小时。
4℃ 14000 rpm离心20min以收集mRNA，弃上清，加-20℃预冷的75% 乙醇100 μl洗涤沉淀，4℃ 10000 rpm离心5min，弃上清，再按上述方法重复洗涤两次，并于室温晾干。
加适量Milli-Q 水彻底溶解沉淀测定OD260值，加入3倍体积的无水乙醇和1/10体积的3 mol/L NaAc(pH 5.2),混匀后-70℃保存。回收时取出部分储存液，4℃ 14000 rpm离心20min再经75% 乙醇洗涤，晾干即可。

(责任编辑：泉水)

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