(3) 原位杂交

所谓原位杂交是指在保存染色体、细胞或组织结构的前提下，用探针定位检查出相关基因序列。结合免疫细胞化学，原位杂交可以揭示出基因在DNA、mRNA水平的表达。

原位杂交技术最早Pardue and Gall和John etal。分别在1969年发现。最初，放射性标记技术是唯一的方法，其使用受到明显限制。由于非放射性标记技术的简单、高敏感性，为原位杂交技术广泛应用开避了道路。

（一）染色体原位杂交的一般技术

1玻片准备

为了展开染色体，酒精清洁玻片即可。但为了防止细胞和组织的脱落，必须用多聚赖氨酸或APES处理玻片。

2固定

为了保存形态结构，生物材料都必须予以固定。染色体的固定比较简单，甲醇/乙酸固定即已足够。如果是石蜡包埋组织，采用福尔马林固定。冰冻切片采用4%甲醛或Bouin's固定液固定30分钟。应予注意的是，DNA和RNA虽然不和各种交联剂反应。但包围DNA.RNA的各种蛋白质和交联剂反应后，就会遮盖住靶核苷酸。因此，必须采取各种增加通透性的程序。

3玻片上材料的预处理

a. 内源性酶的灭活

如果用酶作为标记物，内源性酶必须预先予灭活。如过氧化物酶，可用1%H2O2/甲醇30分钟处理。至于碱性磷酸酶，由于杂交过程的破坏，残余碱性磷酸酶的活力会完全消失。

b.RNA酶的处理—DNA-DNA杂交时需要处理内源性RNA。

内源性RNA的存在，会由于DNA-RNA的杂交而增加背景。处理方法：DNase-free RAase(100μg/ml)/2×SSC,37℃孵育60分钟。(SSC=150mM Nac1,15mM Sodium Citrate,PH7.4)

c.HC1处理?用200mM HC1处理20-30分钟可以增加信/噪比值，其机理尚不清楚。可能与蛋白的

抽提和部分功能核苷酸片断的溶解有关。

d.去垢剂处理

在脂膜成分未被固定，脱水、包埋等程序抽提时，可以进一步使用去垢剂处理，如Triton X-100,

Sodium dodecyl Sulfate等，同样有助于原位杂交技术。

e.蛋白酶消化

蛋白酶消化有助于增进探针和核苷酸之间的接触性。消化通常用蛋白酶K，溶于20mM Tris-HC1,2mM Cac12，PH7.4 ,37℃ 15-30分钟。蛋白酶K浓度依不同对象来确定。?

例如对染色体和核的分离部分，可以用1μg/ml蛋白酶K

4 探针和靶基因的变性

对染色体DNA的原位杂交，必需进行变性处理。热变性越来越常用，它不仅简单，而且效果很好。对不同的杂交，应试验不同的时间和温度，以找到最佳的变性条件。

热变性时，探针和靶基因可以同时变性。将探针加到玻片上，盖上盖玻片。玻片放到80℃，2分钟后取出冷却至37℃。如果是组织切片，变性时间应达到80℃10分钟。组织和细胞mRNA的杂交则不需变性处理。

5杂交后的冲洗

标记探针能够和其序列具有部分同源性的基因非特异性的杂交。这类杂交分子的稳定性总是不及完全同源的杂交分子。分别用不同强度冲洗液可以有效地洗掉非特异杂交的/探针，而保留特异杂交的探针。冲洗液的强度可通过改变甲酰胺浓度、盐浓度和温度来控制。通常用2×SSC＋50%甲酰胺来冲洗。有时可用更高强度的冲洗液。总的来说，杂交时用高强度缓冲液，冲洗时用低强度的冲洗液(盐浓度越低，甲酰胺浓度越高和温度越高，则冲洗强度越大)。

6免疫细胞化学

免疫细胞化学和常规方法一样，必须先进行非特异性的封闭处理。如探针为地高辛标记时，Tris-HC1缓冲液含“Blocking Reagent”。此外0.4M NaCl的加入也有助于降低背景。 免疫细胞化学中最常用的酶是过氧化物酶和碱性磷酸酶。前者用DAB作显色剂。后者用BCIP/NBT作显色剂，方法同膜上杂交。显色强度由显微镜下控制。

7影响原位杂交的主要因素

a.探针长度：原位杂交和其它杂交方法不同，它要求较短的探针。因为探针越短，渗透性越强，可以渗透至细胞内部和染色体。不同的杂交所允许的最小核苷酸如下述公式所计算：

b.探针浓度：浓度越高，则杂交速度越快。但过高的浓度也会使背景增加，因此，宜选择可接受背景的最高探针浓度。

c.硫酸萄聚糖：在水溶液中，硫酸萄聚糖是高度水化物质，因此使得大分子(如探针)难以接触到其结合水，相对浓度大大增加，杂交速度明显加快。

d.碱基错配：碱基错配会引起杂交速度及二倍体的稳定性下降。因此在严格的杂交条件下，可以阻止探针与靶基因的非特异结合。

e.冲洗条件

8杂交标准条件?

适于DNA探针〉100bp

⊙50%去离子甲酰胺

⊙2×SSC

⊙50mM NaH2PO4/Na2HPO4,  PH7.0

⊙1mM EDTA

⊙载体DNA

任选组合：

1×Denhardt`s

dextran sulfate,1-10%

温度37-42℃

杂交时间：5-16小时

（二）  组织切片的原位杂交

目前，原位杂交已成病理学的一个有力工具，原位杂交可以用于诸如病毒，癌基因，基因突变等领域的检查。尤其是非放射性标记探针技术，为更多的实验室广泛应用原位杂交创造了条件。对福尔马林固定、石蜡包埋切片的原位杂交，关键是以下三个步骤：

①靶DNA的暴露。这要靠精心设计的消化步骤。

②DNA的变性和杂交。

③杂交的分子的冲洗和检测。

1探针的准备

2玻片的处理

①去污剂浸泡一晚，大量自来水冲洗，然后用蒸留水清洗。

②干燥之后，浸入丙酮中3分钟。

③玻片移入1：50丙酮稀释的APES溶液中，浸泡5分钟。

④玻片用蒸馏水略加清洗。干燥备用。处理后的玻片置干燥无尘环境可保存半年。玻片也可用“多聚赖氨酸”处理。

3组织切片的准备

①组织用常规4%中性缓冲甲醛溶液固定，石蜡包埋。

②常规切片。切片捞于涂有粘片剂的玻片上。

③切片处理：先置60℃烘片30分钟。

二甲苯脱蜡，逐级酒精至水清洗。

④临用前配制蛋白酶K溶液：

储备液：Proteinase K,10mg/ml H2O，小量分袋-20℃保存。将储备液用TES稀释成100μg/ml。（TES=5mM Tris-HC1,10mM EDTA,10mM Nac1,PH7.4）

⑤每张切片用Proteinase k  20-30μl 37℃消化5-15分钟。消化过程中加盖硅化盖玻片，并置湿盒中。注意消化对组织原位杂交是至关重要的。过度消化会导致切片消失殆尽，消化不足则敏感性不够，因此应针对不同组织尝试不同的消化条件。

4杂交

①蛋白K消化后，去除盖玻片。用4%甲醛4℃固定5分钟。

②蒸馏水洗5分钟。

③让切片上水分滴下去，并在室温干燥5分钟。注意只能让切片上水份减少，不能让切片完全干燥。④每张切片加5-10μl探针(大切片需相应增加)。

⑤设立严格的对照组，每张切片加5-10μl不加探针的杂交液。

⑥切片上加硅化盖玻片，将玻片置+95℃变性6分钟。

⑦把玻片放到冰上1分钟。

⑧切片置温盒，42℃杂交3小时以上。如果方便，应杂交过夜。

5冲洗

去掉盖玻片，按下述程序冲洗

2×SSC洗5分钟×2次(室温)

0．1×SSC洗10分钟(42℃)

6杂交分子的免疫检测

①切片置于0．1M TBS缓冲液中，PH7．4

②每张切片加20-40μl封闭液：1%Blocking Reagont/0.1M TBS。?室温反应15分钟。

③用封闭液1：1000稀释Biotin—Mouse  Anti—Digoxin  , 每张切片加20-50μl稀释试剂，湿盒室温反应1-2小时。用0．1M TBS洗5分钟×3次。

④用封闭液1：1000稀释SABC，37℃反应60分钟。0．1M TBS洗10分钟×3次。

⑤配显色剂：将DAB储备液用0．1M PBS，PH7．5缓冲液1：20稀释。加最终为0.03%H2O2。每    

  张切片加50μl，一般显色5-30分钟。信号弱时显色延长。

（三）细胞的原位杂交

下面的程序是用标记DNA探针来检测培养细胞中的mRNA。其它类型的检测可以参照此程序进行。

1.细胞准备，固定和增加通透性

注意：所有溶液都必须用RNase抑制剂处理。

①玻片用多聚赖氨酸处理。直接用5% CO2在玻片上培养细胞。所用培养基为无酚红Dulbecco's基础培养基。

②37℃PBS清洗细胞。然后用下述固定液室温固定30分钟：4%甲醛，5%乙酸和0．9%NaC1。③室温PBS清洗固定细胞，用70%乙醇储存于4℃?④杂交前用下述方法脱水：

70%，90%和100%乙醇；10%二甲苯；然后再用100%，90%，70%乙醇，最后PBS洗二次。

⑤用胃蛋白酶消化固定细胞：0.1%Pepsin/0.1N HC1,37℃5-10分钟。

⑥PBS洗5分钟后，1%甲醛固定10分钟。PBS洗。

其余步骤参照组织切片程序实行。

(4) 各种溶液的配制

1×SSC：150mM Nacl,  15mM  Sodium Citrate PH7.0

20×SSC：3M Nac1,    300mM Sodium Citrate PH7.0

10×SSC：1.5M Nac1 ,  150mM Sodium Citrate PH7.0

Washing Solution 2×SSC：300mM Nac1,  30mM Sodium Citrate

 Washing Solution 0.5×SSC：0.5×SSC+0.1%SDS

Washing Solution 0.1×SSC:   0.1×SSC+0.1% SDS

N-Lauroylsarcosine:10%(w/v)in Sterile H20,filtered through a 0.2-0.45μm membrane

SDS 10%(w/v)in Sterile H2O:filtered through a 0.2-0.45μm  membrane

Denaturation Solution(for Southern transfer)：0.5N NaoH,1.5M Nac1

Neutralization Solution(for Soutiern transfer)：0.5M Tris-HC1,3M Nac1,PH7.4

Blocking Reagent ：

①加10g Blocking Reagent至100ml 0．1M TBS，PH7．4缓冲液中。搅拌以助溶解。 ②如果必要时，加0．1%DEPC(dimethylpyrocarbonate)。

Standard hybridization buffer:： 5×SSC,0.1 N-lauroylsarcosine 0.02% SDS 1% Blocking Reagent

Standard hybridization buffer+50% formamide：5×SSC， 50% deionized formamide,

    0.1% N-Lauroylsarcosine,0.02% SDS?， 2% Blocking Reagent

High SDS Concentration hybridization buffer： 7%SDS,50% deionizod formamide,5×SSC, 2% Blocking Reagent,50mM Sodium Phosphate,PH7.0， 0.1% N-Lauroylsarcosine 500ml High SDS hybridization buffer可按下述方法配制：

100% deionized formamide250ml， 30×SSC83ml， 1M sodium Phosphate,PH7.0 25ml，

10% blocking solution100ml，10% N-Lauroylsarcosine 5ml

将上述混合液倒入有35g SDS的烧瓶中(通风橱)。搅伴促进溶解，最后加入灭菌水至500ml。储存于-20

Detection Washing buffer：0.1M Tris-HC1,0.15M NaC1,PH7.4

 Detection buffer： 0.1M PBS,150mM Nac1,PH7.4

 TE buffer：10mM Tris-HC, 1mM EDTA,PH8.0 。

玻璃和塑料器皿的硅化：先将待硅化器皿放入玻璃真空干燥器中；加1ml二氧二甲基硅烷于一小烧杯中，放入干燥器。将真空干燥器与真空泵相连。抽气至二氯二甲基硅烷沸腾。关闭真空泵，保持干燥器的真空。1-2小时后，慢慢往干燥器内通气，取出器皿180℃烘烤2小时，塑料器高压消毒，用前用水冲洗干净。

使用注意事项

核酸探针的标记及杂交是一个很复杂的过程，步骤多耗时长，影响因素多。要想获得理想结果，每一步都应严格操作。下面几个问题尤其应予注意：

无菌操作：标记和杂交的各种溶液应高压灭菌；含SDS，Tween20的溶液应在滤膜除菌后加入其它溶液；使用灭菌吸头。

使用干净平皿：每次用前必须严格清洗。

膜的操作：操作膜时戴无尘的手套；只用无齿镊操作膜的边缘。

原位杂交：每步反应均应加盖硅化的盖玻片