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去年4月，美国太平洋生物科学公司（Pacific Biosciences, PacBio）宣布将开始销售其商业化的PacBio RS系统，该公司预计第三代测序产品的发售将“立即扩展DNA测序在癌症研究、病原体检测和农业等领域的应用”。与市场上的第二代测序系统不同，PacBio RS系统能够实现单分子实时测序，在一天内生成结果。此外，跨越数千个DNA碱基的长序列读取使得从头测序成为可能，通过跨越重复区域简化序列组装，并增强对拷贝数变异的检测。由于无需DNA扩增，该系统减少了基因组覆盖度中的人为假象和偏差。

然而，一年多过去了，研究人员对采用第三代测序技术仍持谨慎态度。原因之一是错误率相对较高。尽管通过环形共有序列（CCS）对较短模板进行多次测序可获得高准确度，但PacBio RS仪器生成的平均单次读取核苷酸准确度低于85%。国家生物防御分析与对策中心基因组学研究员Adam Phillippy指出：“这些测序读取的高错误率已被视为该技术的主要限制。”

为解决这一问题，Adam Phillippy及其同事开发了一种新的融合技术，将第二代和第三代测序技术结合，生成了近乎完全准确的长读取。该成果于7月1日发表在《自然生物技术》杂志上。将该技术应用于鹦鹉基因组，首先通过绘制短读序列计算高度准确的融合共有序列，从而校正个别的长读序列。短读和PacBio RS CCS通过454和Illumina测序仪生成，长单次读取通过PacBio RS生成。Phillippy表示：“我们开发了首个能够校正和组装PacBio RS单分子序列读取的算法，并证实PacBio RS技术的高错误率可以得到控制，从而显著改善基因组和转录组的组装。”

和平共存？

但仍有许多工作要做。例如，软件开发商需要更多时间来适应新仪器。Phillippy说：“第三代测序仪正在生成一种全新类型的测序数据。过去5年或更长时间里，算法开发几乎完全集中于高通量、高准确度的短读数据。将软件开发转向新焦点还需要相当长的时间。”Phillippy的算法是朝着正确方向迈出的一步，因为校正后的读取可以利用现有无法处理高错误率的生物信息工具进行分析。

该技术还需改善可靠性、通量和成本才能具有竞争力。Phillippy说：“从454和Illumina技术引入到被广泛接受，并将Sanger测序推至次要角色之前，也存在相似的两至三年滞后。”

Pacific Biosciences正致力于改善仪器通量及延伸读取长度。公司产品管理总监Edwin Hauw说：“系统硬件本身未改变，但我们正在改进化学和软件。”目前，该系统非常适用于研究微生物基因组，但其通量限制了对更大基因组的研究。“对于某些应用，成本高昂，因此对人类基因组或其他大型基因组采用靶向测序是当下最佳策略，”Hauw说。

一旦这些障碍被克服，新技术将使研究人员能够深入了解许多与拷贝数变异和其他大型结构变异相关的疾病，例如癌症、自闭症和染色体疾病。长单分子测序也可揭示对基因组非编码内含子和基因内区域中“无用DNA”的认识，这些区域被认为起着重要的调控作用，但由于无法正确组装而未得到广泛研究。

但第三代测序技术不太可能很快取代现有技术。最终，测序技术的选择将取决于特定的研究问题。例如，群体研究需要高深度测序，人类单核苷酸多态性调查或表达研究等仍最好用第二代技术以极低成本生成大量数据。Phillippy说：“直到第三代技术能够与这种每个碱基的成本相称，其在读长尤其重要的应用（如基因组组装或结构变异研究）中才会受到限制。我期望第二代和第三代技术将和平共存，直至下一个巨变。”

（生物通：何嫱）