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CRISPR-Cas9介导的基因敲入通常依赖同源定向修复（HDR），但该途径仅在增殖细胞中活跃，且需要较长的同源臂。相比之下，非同源末端连接（NHEJ）和微同源介导的末端连接（MMEJ）虽可在多种细胞类型中发挥作用，但其修复结果往往不可预测，常导致整合位点周围及转基因内部发生缺失，可能破坏邻近基因。

在人类中，天然存在的DNA双链断裂通常能被精确修复，但偶尔发生的微同源介导修复会导致遗传错误。微缺失变异占所有临床致病序列变异的20%-25%，其中大多数表现出微同源介导的特征——这为利用这一天然修复机制实现可编程的基因整合提供了契机。

研究者发现，在基因组与供体DNA的交界处的修复结果并非随机，而是遵循序列上下文依赖的规则，并可被深度学习模型（如inDelphi）预测。基于此，他们设计了一种包含串联重复的微同源序列的修复模板。

基本原理：当inDelphi模型预测某一位点主要会通过特定长度的微同源介导删除时，通过在供体模板两侧加上该长度的序列串联重复，可引导修复结果朝向预期方向。通过对人类1号染色体上250,000个假定gRNA靶点的模拟显示，使用串联重复可增加人工微同源在修复中的使用率，在五个串联重复时趋于平台期。但修复结果高度依赖于局部序列上下文，这要求为每个gRNA及其周围基因组序列计算最优设计。

在HEK293T细胞的AAVS1安全港位点验证中，携带5×3-bp微同源串联重复的线性化供体，实现了5.2%的GFP+细胞（靶向整合），而非线性化供体仅为随机整合。边界扩增子测序证实，微同源串联重复的使用率与inDelphi预测显著相关（左交界 r=0.81, 右交界 r=0.97）。此外，高达73%的左交界和78%的右交界序列未发生基因组侧翼的缺失。

靶向32个非必需基因的实验表明：核苷酸-4位（以NGG PAM为0-2位）为G时，推动整合效率的能力是弱碱基（A或T）的1.8倍，且与预测分布完全吻合。inDelphi预测的+1插入比例与整合效率呈中等负相关（r=-0.512），而完美修复比例与整合效率呈正相关（r=0.51）。当inDelphi预测的+1插入比例<25%时，整合效率中位数是>25%情况下的2.2倍。

研究者在热带爪蟾第1号染色体drg1与eif4enif1基因间区鉴定并命名为h11安全港位点。通过共注射两个靶向h11的gRNA（间距767 bp）和携带4×3-bp微同源串联重复的供体，在胚胎中观察到稳定的eGFP表达。F0代成蛙肾脏中观察到转基因活性，50%的F0动物传递了转基因，F1代表现出组织特异性GFP表达，并成功建立了F2纯合子系。该方法成功实现了pax8-CNS1:egfp和心脏肌动蛋白:dsRed2转基因的靶向整合。使用6-bp的框内保留串联重复，成功实现了内源蛋白Myh9和Acta2的C端标记（通过靶向最后一个外显子），以及Ncam1的标记（通过外显子-内含子边界），并观察到了预期的表达模式。

传统HDR在非增殖的成体神经元中效率极低，常用NHEJ依赖的方法（如HITI）。本研究在Tubb2a基因的3'端设计框内eGFP标记，通过AAV递送至成年小鼠视觉皮层。3周后，免疫组化和全脑光片成像均检测到eGFP标记的神经元，与内源Tubb2a共定位。与仅使用NHEJ（HITI，占编辑结果的1.8%）相比，添加微同源串联重复的MMEJ途径活跃，占编辑结果的8.6%。总体而言，使用微同源串联重复修复臂使包含框内突变的序列数量增加了4.8倍，无瘢痕基因标记率提高了2倍。

研究者还将inDelphi的预测能力扩展至单链寡脱氧核苷酸修复模板的设计，用于实现精确的小范围碱基编辑（如单碱基或双碱基替换）。通过生成皮提亚矩阵，可以预测给定模板的编辑效率。在人源eGFP-to-eBFP报告细胞系中测试了90种不同设计的ssODN，实验测得的转换效率与皮提亚评分呈单调节相关（Spearman相关系数 r=0.77）。在热带爪蟾的酪氨酸酶基因中，设计引入两个沉默突变（间隔5 bp）。皮提亚评分预测了短修复臂侧的效率较差，与实验结果一致（远侧效率仅1.4%）。在一项比较不同长度模板的实验中，在等摩尔但亚致死核苷酸浓度下，预测最优模板实现了最高比例（3.2%）的无瘢痕碱基替换。

研究者提供了免费的网络工具：https://www.pythia-editing.org，用于微同源串联重复介导的整合和皮提亚编辑的自动化设计。