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新冠疫情（COVID-19）全球大流行时期，抗体作为机体对抗病毒的重要武器，可在病毒暴露前后发挥预防或治疗作用。迄今为止，已有几款单克隆抗体（mAb, monoclonal antibodies）疗法获得FDA紧急使用授权（EUA），用于治疗轻中度COVID-19患者、或用于COVID-19暴露前预防。NMPA也批准了长效新冠中和抗体联合疗法的上市，用于治疗COVID-19患者。

基于mRNA-LNP（纳米脂质体）平台，北京微生物与流行病学研究所秦成峰团队合成了mRNA-HB27-LNP，可在体内编码新冠病毒单克隆抗体（以下简称单抗）HB27。小鼠模型显示，单剂量给药1天、7天及63天后，mRNA-HB27-LNP可有效保护小鼠免受新冠病毒感染。在密切接触传播模型中，单剂量给药mRNA-HB27-LNP可有效预防仓鼠间的新冠病毒传播。

研究结果2022年1月发表在Cell Research杂志。

一、mRNA-HB27-LNP的合成与表达验证

作者在前期研究中开发了一种单抗HB27，可靶向新冠病毒刺突蛋白（S蛋白）的受体结合域（RBD），有效中和新冠病毒。因此，这项研究基于mRNA平台合成mRNA-HB27-LNP，在体内编码HB27，从而发挥免疫功能。

序列设计（Sequence Design）。mRNA序列由5’ cap（帽结构）、5’ UTR（非编码区域）、ORF（编码HB27轻/重链的开放阅读框）、3ʹ UTR和3’ polyA尾（多聚腺苷酸尾）组成，其中5’ UTR序列为非洲爪蟾β珠蛋白基因的部分序列（xenopus laevis Beta globin gene），3ʹ UTR序列为人α-珠蛋白基因的部分序列（Homo sapiens hemoglobin subunit alpha gene），HB27抗体编码序列进行了密码子优化。

mRNA的制备（mRNA Preparation）。以线性化质粒为模板，体外转录生成编码HB27抗体重链和轻链的mRNA。转录体系中添加假尿嘧啶，获得核苷酸修饰的mRNA-HB27。

体外表达（In vitro expression）。将mRNA-HB27转染至多种细胞系（HEK293T、Vero和Expi293F），转染24小时后可检测到HB27抗体的表达。免疫荧光分析显示，1 μg mRNA-HB27转染Vero细胞，24小时后可有效中和新冠病毒SARS-CoV-2。细胞转染结果显示，mRNA-HB27在体外合成具有生物活性的HB27抗体。

LNP封装（LNP formulation）。将可电离脂质、辅助磷脂、胆固醇和聚乙二醇化脂质以一定比例混合，溶解在乙醇中形成脂质MIX，然后与HB27轻/重链mRNA混合，在微流控下完成封装，制备得到mRNA-HB27-LNP。

体内表达（In vivo expression）。将mRNA-HB27-LNP注射至小鼠体内，24小时后采集小鼠血清，分别进行酶联免疫吸附试验（ELISA）和假病毒中和试验。结果显示，在小鼠血清检测到HB27抗体，且具有假病毒中和活性。

星耀小TIP：

① 5’和3’端UTR序列（非编码序列），可调控mRNA的翻译、半衰期和亚细胞定位。高表达基因的天然UTR是合成mRNA的首选，如α-和β-珠蛋白基因。

② 为达到有效的翻译水平，mRNA通常包含修饰的核苷（modified nucleosides），如假尿嘧啶（pseudouridine）、N1-甲基化假尿嘧啶（N1-methylpseudouridine）等。未修饰的mRNA可被模式识别受体识别（pattern recognition receptors），激发机体固有免疫；使用修饰后的核苷，特别是修饰后的尿嘌呤（uridine），可以避免mRNA被模式识别受体识别，同时能提高翻译效率。

二、mRNA-HB27-LNP可有效预防新冠肺炎

向小鼠体内注射mRNA-HB27-LNP（单次给药），1天后进行病毒挑战试验，使用致死量的MASCp36（致死性毒株）进行鼻内挑战。生存曲线分析显示，安慰剂组小鼠出现典型呼吸道症状，5天内死亡；mRNA-HB27-LNP 1 mg/kg剂量组与0.2 mg/kg剂量组的小鼠全部存活，且无临床症状，0.04 mg/kg剂量组小鼠的存活率为80%。

实时定量PCR（RT-qPCR）结果显示，安慰剂组小鼠肺部检测到高水平的病毒载量；mRNA-HB27-LNP 1 mg/kg剂量组与0.2 mg/kg剂量组小鼠肺部病毒RNA载量低于检测下限，0.04 mg/kg剂量组小鼠肺部RNA载量较安慰剂组降低约100倍。

病理学分析显示，安慰剂组小鼠出现明显的肺损伤；mRNA-HB27-LNP 1 mg/kg剂量组与0.2 mg/kg剂量组未观察到肺部损伤，0.04 mg/kg剂量组仅观察到轻度/极轻度的炎症细胞浸润。

以上结果表明，接种1 mg/kg剂量或0.2 mg/kg剂量的mRNA-HB27-LNP，可完全清除病毒，保护小鼠肺部不被感染。

另外，研究使用Beta变异株进行病毒挑战试验，以进一步评估1 mg/kg mRNA-HB27-LNP对Beta变异株的对抗作用。结果显示，mRNA-HB27-LNP完全清除小鼠肺部病毒。

三、mRNA-HB27-LNP有效阻断新冠病毒在仓鼠间的传播

研究以仓鼠为动物模型，评估了mRNA-HB27-LNP在密切接触传播模型中的保护效力。结果显示，安慰剂组密接仓鼠的肺部检测到高水平的病毒载量；接种0.3mg/kg或1mg/kg剂量的mRNA-HB27-LNP大幅降低了病毒RNA载量，其中高剂量组一只仓鼠肺部病毒完全被清除。

病理学分析进一步表明，接种mRNA-HB27-LNP的仓鼠未观察到明显肺部病变。

以上结果表明，预防性接种mRNA-HB27-LNP可有效阻断新冠病毒在仓鼠密切接触模型中的传播。

四、mRNA-HB27-LNP具有长期保护疗效

研究进一步验证了mRNA-HB27-LNP的长期保护效应。向小鼠注射1mg/kg mRNA-HB27-LNP，分别在给药后7天或63天进行MASCp36鼻内挑战。结果显示，给药7天后，接受HB27单抗或mRNA-HB27-LNP治疗的小鼠全部存活，并且在22天的观察期间全部存活。给药后63天，mRNA-HB27-LNP仍保护了50%的小鼠免受病毒挑战。

以上结果验证了mRNA-HB27-LNP的长期保护效应。

五、总结

近年来，递送技术的进展推动了编码单抗（mAb）的mRNA-LNP平台的兴起。有多款编码单抗的mRNA药物处于临床试验阶段，用于传染病或癌症的预防及治疗。这篇文章首次报道了对抗新冠病毒的mRNA抗体的开发。数据表明，编码HB27单抗的mRNA-HB27-LNP可阻断新冠病毒的体内复制，减轻小鼠肺部损伤，并降低死亡率。在新冠密切接触模型中，mRNA-HB27-LNP可有效保护密接仓鼠免受感染。该结果支持将mRNA抗体药物进一步开发至临床试验。另外，研究以HB27单抗为对照，验证了mRNA-HB27-LNP的长期保护作用，提示mRNA单抗的潜在优势。

这项研究基于动物模型，验证了mRNA单抗可有效预防新冠感染，同时彰显了mRNA技术平台广泛用于多种疾病领域的潜力。

耀海生物科研级mRNA服务能力

为快速推进mRNA的研发进程，耀海生物推出以下mRNA预制品：mRNA-1273（Moderna·S蛋白全长）、mRNA-162b2（辉瑞·S蛋白全长）、mRNA-eGFP（增强绿色荧光蛋白）和mRNA-luciferase（细菌荧光素酶），可在3-7个工作日内完成交付（由于RNA稳定性不高，公司采用现货生产）。

为满足广大客户的定制化合成需求，耀海生物可提供序列设计与优化、转录模板制备、体外转录、mRNA纯化的一站式服务，具备以下特色：

• 建立了天然UTR库，提供多元化的UTR来源选择，可针对不同品种匹配合适的UTR序列；可对天然5’ UTR进行优化改造；
• 采用国际前沿的设计策略优化密码子、PolyA尾等结构；
• 多样化的核苷酸修饰，以有效降低免疫原性；
• 高产稳定的加帽工艺，包括酶法加帽和共转录加帽；
• 成熟完善的纯化平台，LiCl沉淀、磁珠纯化和层析纯化，可有效去除mRNA制备过程产生的各种杂质（层析纯化方案由耀海生物完全自主开发）；
• 最长可满足10,000 nt左右的定制化mRNA制备需求；
• 完善的质量分析与控制平台；
• 交付周期短，最快7个工作日内交付

为了验证mRNA-eGFP（mRNA预制品）的表达效果，我们使用了一款常规脂质体转染试剂，向293细胞系中转染了mRNA，转染24小时后实现高水平的荧光表达，结果如下：

参考文献：

Deng YQ, Zhang NN, Zhang YF,et al. Lipid nanoparticle-encapsulated mRNA antibody provides long-term protection against SARS-CoV-2 in mice and hamsters. Cell Res. 2022 Apr;32(4):375-382. doi: 10.1038/s41422-022-00630-0.

耀海生物，作为中国生物医药产业蓬勃发展的亲历者和见证者，深耕微生物表达体系CDMO服务多年，业务聚焦在重组蛋白/多肽、质粒/mRNA、纳米抗体、新型重组疫苗等领域，致力于打造CRO/CDMO/MAH开放式、全方位、一体化的产研服务平台。

用心服务，共创未来。十年来，耀海生物坚持创新发展，坚定不移走在不断提高和完善研发、生产、质量管理与控制服务体系的道路上，以平台技术构筑实力底蕴，并以全面的服务能力、丰富的项目经验及规模领先优势，为国内外制药公司提供从工艺开发到商业化生产的全生命周期CDMO服务，助推客户新药项目顺利推进，为中国生物医药产业发展持续赋能。