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描述

PDS1::HA免疫荧光实验的操作流程包括细胞培养、固定、洗涤和抗体孵育等步骤，旨在观察细胞中PDS1::HA的表达情况。

实验步骤

1. 细胞培养：培养1500和1501细胞系，待细胞浓度达到OD 0.5。

2. 固定：将细胞分别在4%甲醛和0.1 M KPO4（pH 6.5）中固定10、20、30和45分钟，或在4%甲醛、50 mM KPO4（pH 6.5）和0.5 mM MgCl2中固定15分钟。

3. 收获细胞：分别收获24毫升和6毫升的细胞培养液。将24毫升细胞重悬于10毫升4%甲醛、0.1 M KPO4（pH 6.5）中，6毫升细胞重悬于2.5毫升4%甲醛、50 mM KPO4（pH 6.5）和0.5 mM MgCl2中。

4. 旋转孵育：在23℃下旋转孵育，指定时间后（首次旋转前2分钟）取出1.5毫升细胞，室温下用1毫升0.1 M KPO4（pH 6.5）洗涤4次（以10K转速离心1分钟）。

5. 进一步洗涤：用0.1 M KPO4和1.2 M山梨醇洗涤一次，重悬于1毫升0.1 M KPO4和1.2 M山梨醇中。

6. 细胞球化：通常将0.5毫升细胞进行球化处理，其余细胞在4℃保存以备不时之需。向0.5毫升细胞中加入0.5毫升含1%β-巯基乙醇和10单位草酸酶（1 mg/mL库存）的0.1 M KPO4和1.2 M山梨醇混合液。

7. 细胞检查：在23℃下旋转孵育，20分钟后检查细胞是否球化，细胞在加入水后会膨胀（爆炸）。

8. 准备涂层载玻片：在细胞球化的同时，准备聚赖氨酸涂层的载玻片。

9. 收获球化细胞：通过3-5分钟的离心（3K转速）收获球化细胞，用P1000轻轻重悬细胞，避免涡旋。重悬洗涤后的细胞于0.5毫升0.1 M KPO4和1.2 M山梨醇中。

10. 加入细胞：每个聚赖氨酸涂层的孔中加入20微升细胞，静置10-20分钟后吸去上清液，立即（但轻柔地）将载玻片浸入-20℃的甲醇中6分钟，再转移至-20℃的丙酮中30秒。

11. 干燥和抗体孵育：让载玻片空气干燥1-2分钟，在每个孔中加入20微升PBS-BSA（1X PBS，1% BSA），将载玻片放入湿润室至少5分钟。吸去PBS-BSA后，加入稀释的初级抗体（可尝试1:1000、1:2000和1:3000的稀释度）。

12. 次级抗体孵育：用每孔15微升的次级抗体（山羊抗小鼠Cy3，1:1000）孵育2小时，避光。洗涤3次PBS-BSA，再用普通PBS洗涤2次。

13. 封片：最后吸去最后一次洗涤液，在每个孔中加入一滴含DAPI的封片介质，盖上盖玻片，避免气泡，并用指甲油密封。将载玻片存放在-20℃。