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背景介绍

干扰素γ（IFN-gamma）是一种重要的细胞因子，在免疫系统中发挥关键作用，能够增强细胞对病毒感染的抵抗力。本实验旨在评估IFN-gamma对L929小鼠成纤维细胞和A549人肺癌细胞系抵抗EMC病毒感染的保护效果，采用MTT法检测细胞存活率。

实验材料与仪器

L929小鼠成纤维细胞（ATCC Cat. No. CCL-1）或A549人肺癌细胞（ATCC Cat. No. CCL-185）；RPMI培养基（补充10%胎牛血清用于培养，2%胎牛血清用于实验）；96孔平底培养板（Costar Cat. No. 3595）；EMC病毒（107 pfu/ml，-80℃保存）；MTT溶液（Sigma Cat. No. M5655，5 mg/ml，避光室温保存）；MTT裂解液（20% SDS/50% DMF）；移液器及吸头；恒温湿度培养箱；96孔微孔板分光光度计。

实验步骤

1. 准备L929或A549细胞悬液，浓度为3.5×10⁵/ml，用实验培养基稀释。每孔加入100 μl细胞悬液，置于96孔板，37℃、5% CO₂湿度培养箱中过夜培养。
2. 按照标准曲线范围进行2倍梯度稀释，将样品和标准加入96孔板第2至12排，第1排为空白。培养6小时。
3. 小心吸去孔内上清液，每孔加入100 μl EMC病毒溶液（浓度1-4×10⁴ pfu/ml）。人IFN-gamma用1/250稀释，鼠IFN-gamma用1/1000稀释。
4. 37℃、5% CO₂条件下培养40小时。
5. 每孔加入10 μl 5 mg/ml MTT溶液，继续培养4小时。
6. 每孔加入50 μl MTT裂解液，过夜培养。
7. 用分光光度计在570-650 nm波长读取吸光度，绘制标准曲线并分析数据。

实验提示

所有操作需严格无菌，MTT溶液需避光保存。病毒操作需遵守生物安全规范。