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瞬时表达分析是一种常用的研究基因功能和表达调控的技术。本文介绍了一种使用拟南芥叶肉原生质体进行瞬时表达分析的实验方法，包括原生质体的分离、转染及相关试剂的配方。

实验材料

选取生长在B5培养基上的拟南芥植株，或温室中生长的Col、Ler和C24植株。使用3-4周龄、开花前、叶片充分展开的植株（第二和/或第三/第四对叶片，1-2 cm）。对于Col和Ler等在长日照条件下较早开花的品种，建议缩短光周期（12-13小时光照或更少）。

原生质体分离步骤

使用新鲜的剃刀片将叶片切成0.5-1 mm的条状，避免伤及叶片。这是实验中最繁琐的步骤，但比逐片剥离下表皮更为高效。高质量的制备可以从每克鲜重叶片中获得约10^7个原生质体（约100至150片叶子在40-60 ml酶解液中消化）。对于小规模实验，10-20片叶子在5-10 ml酶解液中消化即可获得0.5-1 x 10^6个原生质体，足够用于50-100个样本（每个样本1-2 x 10^4个原生质体）。

将叶片条放入带有侧臂的烧瓶中（对于10 ml酶解液使用125-ml烧瓶），进行真空渗透5-30分钟，或直接将叶片条放入Petri dish中并置于真空干燥器中。确保叶片条完全浸入酶解液中。继续在黑暗中消化60-90分钟，期间轻微摇动（40 rpm），或不摇动消化3-12小时。具体时间需根据实验目标和预期反应进行调整。酶解液应变绿，表明原生质体已释放（在显微镜下观察，拟南芥叶肉原生质体的大小约为30-50 μm）。通过摇动（80 rpm，1分钟）释放原生质体。

使用35-75 μm尼龙网过滤含有原生质体的酶解液。在圆底管中以100 x g离心1-2分钟收集原生质体（例如，使用IEC临床离心机，速度3）。如果原生质体回收率低，可以提高离心速度或添加CaCl2（50 mM）。轻轻摇动即可重新悬浮沉淀的原生质体。用冷的洗涤/孵育（WI）溶液洗涤原生质体一次，用于电穿孔；或用W5溶液洗涤，用于PEG转染。将原生质体重新悬浮在相同的溶液中，浓度为2 x 10^5/ml。在WI或W5溶液中，将原生质体置于冰上30分钟后再进行转染。对于某些实验，也可以在室温下保存原生质体（需进行测试）。虽然原生质体可以在冰上保存至少24小时，但对于研究受调控的基因表达、信号转导和蛋白质运输、加工和定位等，建议使用新鲜制备的原生质体。

试剂配方

酶解液

1-1.5%纤维素酶R10（RS太强）
0.2-0.4%果胶酶R10（Yakult Honsha，Tokyo，Japan）
0.4 M甘露醇
20 mM KCl
20 mM MES，pH 5.7
加热酶解液至55°C，10分钟（以灭活蛋白酶并提高酶的溶解度），然后冷却至室温，再添加：
10 mM CaCl2
5 mM β-巯基乙醇（可选）
0.1% BSA（Sigma A-6793）
酶解液应为浅棕色且清澈（通过0.45 μm滤器过滤）。

PEG溶液（40%，v/v）

4 g PEG4000（Fluka，#81240）
3 ml H2O
2.5 ml 0.8 M甘露醇
1 ml 1 M Ca(NO3)2或CaCl2

洗涤和孵育溶液（WI）

0.5 M甘露醇
4 mM MES，pH 5.7
20 mM KCl

W5溶液

154 mM NaCl
125 mM CaCl2
5 mM KCl
2 mM MES（pH 5.7）（不含葡萄糖，因为我们使用葡萄糖作为信号）

MMg溶液

0.4 M甘露醇
15 mM MgCl2
4 mM MES（pH 5.7）