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水稻轰击法是一种用于将外源DNA导入水稻细胞的基因转化技术。本文详细介绍了该实验的步骤、所需设备和试剂。

实验步骤

第1天：

1. 使用640μm的滤网过滤水稻细胞，以获得较小尺寸的细胞。

2. 丢弃上清液。

3. 在N6D 0.5培养基上铺上#4 Whatman滤纸。

4. 将250mg细胞均匀分布在滤纸上，形成单层。

5. 在黑暗中存放4小时。

6. 将10μL至20μL的DNA溶液与M10混合。

7. 加入25μL的CaCl₂，涡旋振荡10秒。

8. 加入10μL的Spermidine，轻敲、涡旋振荡10秒，然后在冰上放置5分钟。

9. 进行轰击实验前进行真空灭菌（压力>65）。

10. 准备轰击装置：打开红色阀门，关闭蓝色阀门（60 psi为水稻的最佳压力），打开绿色阀门。

11. 离心DNA溶液。

12. 丢弃50μL的上清液，剩余15μL用于轰击（可进行两次轰击）。

13. 用移液管轻敲剩余的DNA溶液。

14. 将5μL的DNA溶液滴在小型过滤装置上。

15. 组装过滤装置，将水稻细胞培养皿放在从底部数第六个位置。

16. 将装置抽真空至压力>65，然后进行轰击。

17. 将水稻细胞在黑暗中存放24小时。

第2天：

18. 将细胞转移到N6D培养基（无渗透压调节）中。

第3天：

19. 24小时后，对其中一个样本进行分析（紫外线照射）。

20. 2-3天后，将细胞转移到含有G418（75~100mg/L）或Hygromycin B（50mg/L）的N6D培养基中。

21. 2周后，将细胞转移到新的含有G418或HygB的N6D培养基中。

22. 在6-8周内筛选抗生素抗性细胞群。

试剂和设备

小型过滤装置（5个）、挡板（200μm-400μm不锈钢网）、#4 Whatman滤纸、620μm滤网、黄尖头、N6D 0.5固化培养基等。

N6培养基（pH 5.6-5.8）、2,4-D（2mg/L）、Sorbitol（0.25M）、Mannitol（0.25M）、琼脂（8g/L）等。