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描述

水稻细胞轰击转化技术

操作步骤

第一天

1. 使用640μm的筛网过滤水稻细胞，以获得小尺寸细胞。

2. 丢弃上清液。

3. 将#4 Whatman纸放置在N6D 0.5培养基上。

4. 将250mg细胞均匀涂布在纸上，形成一层。

5. 在黑暗中储存4小时。

6. 向10μL至20μL的DNA溶液中加入M10，混合均匀。

7. 向其中加入25μL的氯化钙，震荡10秒（聚集）。

8. 向其中加入10μL的精胺，轻拍并震荡10秒（在冰上储存5分钟）。

9. 进行轰击真空灭菌（压力>65）。

10. 准备轰击设备：

氦气：红阀，打开；蓝阀，关闭（60 psi：水稻的最佳压力）；绿阀，打开。

11. 离心DNA溶液。

12. 丢弃50μL上清液，保留其余15μL用于轰击（可轰击两次）。

13. 用移液器轻拍剩余的DNA溶液。

14. 将5μL DNA溶液放置在小过滤器上。

15. 组装过滤器，将水稻细胞培养皿放置在底部第六个位置。

16. 通过压力>65进行真空处理，然后进行轰击！

17. 将水稻细胞在黑暗中储存24小时。

第二天

18. 将其转移至N6D（无渗透剂）。

第三天

19. 24小时后，仅分析一个样本（紫外线照射）。

20. 2-3天后，将其转移至N6D G418（75~100mg/L）或氟尿嘧啶B（50mg/L）。

21. 两周后，转移至新的N6D G418或氟尿嘧啶B。

22. 在6-8周内选择抗生素抗性愈伤组织。

配方

设备

小过滤器 5个

挡板（200μm-400μm不锈钢筛网）

#4 Whatman纸

620μm筛网在烧瓶中

黄色移液器尖

N6D 0.5固体培养基

N6（pH 5.6-5.8）

2,4-D 2 mg/L

山梨醇 0.25 M（45.6 g/L）

甘露醇 0.25 M（45.6 g/L）

琼脂 8 g/L（植物胶 2 g/L）

N6D G418

N6D

G418 100 mg/L

过滤器 2个（一个用于氯化钙，另一个用于精胺）

蓝色移液器尖

Eppendorf管

提示