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简介

本文详细介绍了如何制备大鼠视交叉上核（SCN）的分散神经元培养。这一技术在神经科学研究中具有重要意义，尤其是在研究昼夜节律和神经元活动方面。

实验步骤

1. **动物处理**：将大鼠幼崽通过低温麻醉后断头。使用组织切片机（如McIlwain）获得700微米厚的下丘脑额状切片。

2. **SCN分离**：使用手术刀从切片中分离出双侧SCN。

3. **酶消化**：将约15只幼鼠的SCN组织置于含有0.03%胰蛋白酶的等渗盐溶液中，于37℃孵育15分钟。

4. **细胞分离**：用含有0.02%胰蛋白酶抑制剂和0.01%脱氧核糖核酸酶（Sigma）的等渗盐溶液清洗组织。然后使用火焰抛光的巴斯德吸管轻轻吹打10次，将细胞分散。通过200号不锈钢筛网过滤以获得单个细胞。

5. **细胞悬浮**：将细胞悬浮液以1300转/分钟离心5分钟后，将SCN细胞重悬于含有15 mM NaHCO3、10 mM HEPES和20 mg/L卡那霉素（Gibco）的Dulbecco改良Eagle培养基（DMEM）中，细胞浓度调整为10^6个细胞/ml。

6. **细胞培养**：将1.5-1.8 x 10^5个细胞悬浮液接种于直径5毫米的MED探针中央区域。接种后8小时，在培养基中加入2%胎牛血清和激素。每隔一天更换一次培养基，直至开始记录。

7. **神经元活动记录**：培养后4至10天，分散的SCN神经元开始出现自发的单一单位神经元活动，这种活动可以持续26周。在每个MED探针上可以同时记录48个神经元的动作电位。

实验注意事项

1. **细胞活性**：细胞活性应保持在90%以上（最好在93-98%之间），以确保长期记录的成功。细胞解离步骤对细胞活性至关重要。

2. **MED探针表面处理**：在培养前一天，用0.1N HCl处理MED探针6小时，随后用灭菌蒸馏水冲洗3次，再用70%乙醇处理15-30分钟。之后再次用水冲洗，并在紫外线下干燥15分钟。使用蓝色火焰短暂烧灼表面（避免长时间烧灼以免损坏绝缘层）。最后用多聚-L-鸟氨酸过夜涂层，培养当天用含血清的DMEM处理培养皿至少2小时。

3. **细胞密度与血清补充**：建议在MED探针中心区域使用克隆环集中培养细胞，细胞密度为10万至15万个细胞，直径为7毫米的区域。接种后6-8小时移除克隆环，并覆盖含2%胎牛血清的培养基。

4. **抑制胶质细胞过度生长**：通过降低血清浓度和使用Ala C可以抑制胶质细胞的过度生长。

结论

本文提供了一种详细的实验方法，用于制备大鼠视交叉上核分散神经元培养。这一技术为研究昼夜节律和神经元活动提供了重要的实验平台。