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描述

本文详细介绍了视网膜解离免疫组织化学实验的操作步骤、试剂配方以及相关注意事项，为研究人员提供了系统的实验指导。

实验步骤

1. 在开始实验前，请先查阅关于解离细胞评分的标准和指导原则。

2. 用预热的PBS（6 ml，置于6 cm培养皿中）清洗新鲜分离的组织或外植体。

3. 将组织转移至Eppendorf离心管中，加入约200微升PBS和20微升胰蛋白酶储备液。

4. 在37°C下孵育5分钟，同时准备腔室载玻片，在载玻片上滴加1X PBS稀释的1X聚-D-赖氨酸溶液。孵育5分钟后，用1X PBS清洗两次，注意不要让载玻片干燥。

5. 为了进行组织解离，用P1000移液器吸取和释放3-5次，然后将样品放回37°C水浴中孵育2-4分钟。再次吸取和释放，直至形成单细胞悬液。

6. 加入20微升大豆胰蛋白酶抑制剂，轻轻颠倒混匀后加入2微升DNaseI。在37°C下孵育5分钟后再次吸取和释放，随后加入外植体培养基至1.5 ml。

7. 将细胞转移至腔室载玻片中（每个腔室约10^5个细胞），在组织培养箱中37°C孵育15-30分钟。

8. 吸出培养基，立即用4%多聚甲醛固定5分钟。

9. 用1X PBS清洗两次后，在PBS中用3%过氧化氢孵育5分钟。

10. 再次用PBS清洗两次，并用封闭液（1X PBS、2%正常血清、0.5% Triton X-100）封闭5-10分钟。

11. 加入一抗（稀释比例参考Dyer和Cepko的研究），孵育30分钟。

12. 用PBS清洗3次后，加入1:500稀释的二抗，孵育30分钟。

13. 再次用PBS清洗3次，加入少量ABC试剂。

14. 用PBS清洗3次，随后用TNB封闭液（由tyramide试剂盒提供）清洗1次，进行tyramide信号放大。每张载玻片混合150微升放大稀释液和1微升tyramide化合物（NEN），或按1:50,000稀释自制tyramide（参考协议T.4）。

15. 在tyramide溶液中孵育10分钟后，用PBS清洗停止反应。

16. 在PBS中用DAPI染色5分钟，随后用PBS清洗两次，并用gelvatol封片。

试剂配方

• 100X 胰蛋白酶：10 mg/ml溶于1X PBS（Sigma #T2271）。
• 100X 大豆胰蛋白酶抑制剂：10 mg/ml溶于1X PBS（Sigma #T6522）。
• 1000X DNaseI：2 mg/ml溶于HBSS（Sigma #D4513）。
• 外植体培养基：45% HAMS F-12（Gibco #11765-054），45% DME（Gibco #10313-021），10% FCS（HyClone），胰岛素（5 mg/ml 1000X储备液，H2O中溶解，加入HCl），L-谷氨酰胺（200 mM，Cellgro #25-005-CI，10 ml/L），青霉素/链霉素（Cellgro #30-002-CI，10 ml/L），HEPES（Cellgro #25-060-CI，10 ml/L）。
• 20%多聚甲醛/4%多聚甲醛-PBS：200 g多聚甲醛，1 ml 10N NaOH，加水至1 L，加热至65°C溶解，分装后-20°C保存。使用时混合100 ml 20%多聚甲醛与50 ml 10X PBS，加水至500 ml，过滤后4°C保存，保质期2周。
• 1000X 聚-D-赖氨酸：500 mg聚-D-赖氨酸（Sigma），溶于50 ml无菌PBS，分装后-20°C保存。
• 封闭液：1X PBS，2%正常血清（驴、兔或山羊），0.5% Triton X-100，4°C保存1-2周。
• 1000X DAPI：50 mg DAPI溶于10 ml 50%甲醇，避光保存于-20°C，可保存多年。

其他试剂与耗材

• 生物素化二抗（Vector Labs Inc.）。
• ABC生物素/链霉亲和素试剂（Vector Labs Inc.）。
• Tyramide试剂（参考协议T.4）。
• 8腔室载玻片（Cel-line/Eric Scientific Co., 1-800-258-0834, 12 mm 8方形载玻片，特氟龙涂层）。

实验提示

确保所有试剂新鲜配制，实验过程中避免样品干燥。严格按照操作步骤进行，以确保实验结果的可靠性和重复性。