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描述

本文详细介绍了肿瘤坏死因子α（TNF-alpha）诱导L929小鼠成纤维细胞凋亡的实验方法。L929细胞是一种常用的实验室细胞系，用于研究细胞凋亡和细胞毒性机制。本文提供了实验所需的材料、步骤、以及数据分析方法。

实验材料

• L929小鼠成纤维细胞系（ATCC编号：CCL-1）
• 培养基：RPMI培养基，补充10%胎牛血清（FBS）
• 实验培养基：RPMI培养基，补充2%胎牛血清（FBS）
• 96孔平底培养板（Costar编号：3595）
• 放线菌素D，500 μg/ml储备液，-80°C保存，避光
• MTT溶液（Sigma编号：M5655），5 mg/ml储备液，溶于PBS，室温保存，避光
• MTT裂解液：20% SDS/50% DMF

实验仪器

• 移液器及移液枪
• 湿润培养箱
• 96孔微量测试分光光度计

实验时长

• 细胞培养：48小时
• 实验准备：1小时

实验方法

1. 将L929细胞悬浮于实验培养基中，细胞密度调整为3.5×10⁵/ml。每孔加入100 μl细胞悬液至96孔实验板中，在37°C、5% CO2湿润培养箱中孵育过夜。
2. 按照实验设计，将样本和标准品在另一块96孔板中用实验培养基进行2倍梯度稀释，每孔加入100 μl，设置第1行为空白对照。
3. 将500 μg/ml的放线菌素D储备液稀释125倍，制备4 μg/ml的工作液，避光保存。每孔加入50 μl工作液。
4. 将稀释后的样本和标准品各50 μl加入对应的实验板孔中。
5. 将实验板在37°C、5% CO2湿润培养箱中孵育24小时。
6. 每孔加入10 μl 5 mg/ml的MTT溶液，继续孵育4小时。
7. 每孔加入50 μl MTT裂解液，过夜孵育。
8. 使用分光光度计在570-650 nm波长范围内读取吸光度。
9. 绘制标准曲线并分析实验数据。

实验配方

• RPMI培养基：补充10% FBS，过滤除菌后储存于4°C。
• MTT溶液：5 mg/ml溶于PBS，避光保存。
• MTT裂解液：20% SDS和50% DMF的混合溶液，室温保存。

实验注意事项

• 放线菌素D和MTT溶液需避光保存，以防止降解。
• 实验过程中应确保无菌操作，避免污染。
• 孵育时间和温度需严格控制，以确保实验结果的准确性和可重复性。