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流式细胞分析（FACS）是一种强大的技术，用于分析细胞群体的特性。设置正确的颜色补偿对于多色流式分析至关重要，因为不同的荧光染料之间存在光谱重叠。本文提供了设置2或3色FACS分析的详细步骤。

设置颜色补偿的重要性

1. 颜色补偿的准确设置至关重要，因为荧光染料的光谱存在显著重叠。特别是，强FITC信号（FL1）会重叠到FL2，PhycoErythrin（PE，FL2）会重叠到FL3，而串联偶联物（PE与Texas Red或Cy5的化学偶联物，通常在FL3测量）的偶联效率差异很大，因此它们在FL2中的背景发射也不同。因此，FL2-FL1补偿对于双色分析最重要，而FL2-FL1、FL2-FL3和FL3-FL2对于三色设置都至关重要。

2. 进行三色分析时，必须在FACSMate主菜单页面上使用5参数1024分辨率设置，以及在此分辨率下的仪器控制设置（使用4参数256分辨率保存的设置无法在此模式下使用或恢复）。

3. 颜色补偿设置对每个检测器的灵敏度非常敏感 - 您不能更改任何荧光参数（FL1、FL2或FL3）的检测器或放大器增益，而不重新校准补偿值。

4. 要检查或调整补偿，您应该使用单独标记的对照样本。理想情况下，这些应该是您之前运行过的固定标准，而不是当天的单色染色样本。

5. 从FACSmate运行标准样本时，将数据采集模式设置为“无数据”，事件数设置为最多50,000，并以较慢的速度运行（例如每秒200个细胞），以便在样本运行时有足够的时间进行调整。

6. 在运行单色FITC标准样本时，在点图上选择FL1作为垂直轴，FL2作为水平轴。确保阳性群体的右边缘直接位于阴性群体的右边缘上方。

7. 对于双色分析，您需要调整FL2-FL1补偿。对于三色分析，还需要调整FL3-FL2和FL2-FL3补偿。

补偿问题排查

如果您认为样本的补偿不正确，请不要尝试直接补偿样本中的任何不足，而是运行一些特征明确的样本或单色标准来检查机器设置。此外，请确保没有流动问题，并检查散射是否正常。

多色分析的常见问题包括无法消除对角线上的细胞（即明显错误的双阳性细胞）。这可能由非特异性染色、试剂之间的交叉反应或自发荧光引起。