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酵母免疫荧光是一种用于检测酵母细胞中特定蛋白质定位的技术。以下是该实验的详细步骤：

实验步骤

1. 将酵母细胞在YEPD或特定培养基中培养至浓度达到1-5 × 10⁷个细胞/ml（该方案适用于约5 ml指数生长的细胞）。

2. 直接向细胞中添加0.6 ml的37%甲醛溶液，并在与培养温度相同的条件下温和摇动孵育90分钟。

3. 将细胞转移到15 ml锥形管中，通过离心（3分钟，2000转/分钟）收集细胞。

4. 吸去上清液，用5 ml 0.1 M KPO₄（pH 6.5）洗涤细胞。

5. 再次离心收集细胞，用5 ml 0.1 M KPO₄（pH 6.5）/1.2 M山梨醇（P溶液）洗涤细胞。

6. 离心收集细胞并吸去上清液，用约1 ml P溶液重悬细胞。

7. 添加25 μl的二硫苏糖醇（DTT）孵育10分钟，然后添加25 μl的zymolyase。在30°C滚筒上孵育细胞一小时（或直到消化充分）。

8. 离心收集细胞并吸去上清液，用约1 ml P溶液重悬细胞。

9. 将20 μl细胞悬液滴加到预处理的载玻片的每个孔中。几分钟后吸去多余的细胞。

10. 立即将载玻片浸入冰冷的甲醇中6-7分钟，然后取出并浸入冰冷的丙酮中30秒。让载玻片自然干燥。

* 一旦细胞固定后，尽量保持孔中的湿度。

11. 用10 mg/ml BSA（牛血清白蛋白）溶于1X PBS（磷酸盐缓冲液）洗涤载玻片一次。吸去上清液，添加第一抗体（用BSA/PBS稀释）。在湿润的暗盒中孵育至少2小时。

12. 吸去多余的液体，用BSA/PBS洗涤4次。添加20 μl第二抗体（用BSA/PBS稀释）。在黑暗、湿润的条件下孵育约2小时。

* 记住要遮盖载玻片以防止第二抗体的荧光淬灭。

13. 吸去多余的液体，用BSA/PBS洗涤3次，然后用1X PBS洗涤一次。将DAPI（1:1000）稀释于1X PBS中，添加DAPI到孔中孵育几分钟。吸去多余的液体，用1X PBS洗涤一次，让载玻片自然干燥。

14. 在孔上覆盖抗荧光淬灭试剂和盖玻片，并用透明指甲油密封。

试剂配方

0.1 M KPO₄，pH 6.5

0.1 M KPO₄，pH 6.5 / 1.2 M山梨醇（P溶液）

Zymolyase：将10 mg/ml的zymolyase溶于P溶液中，涡旋混合后静置5分钟。然后离心5分钟，取上清液使用。

10 mg/ml BSA溶于1X PBS

1X PBS

抗荧光淬灭试剂：对苯二胺（1个晶体溶于100 μl 10X PBS，然后加入900 μl甘油）

实验技巧

载玻片预处理：将载玻片孔用0.1%多聚赖氨酸涂层，10-30秒后吸去，用水洗涤每个孔三次，让载玻片自然干燥10分钟。