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这篇实验指南描述了一种可视化细胞表面及内部受体的免疫荧光染色技术，特别适用于观察激动剂诱导的受体内化过程。

实验步骤

1. 将细胞接种在18mm的方形盖玻片上，使用聚赖氨酸预处理盖玻片以增强细胞粘附。注意避免细胞过度汇合，以免在后续清洗过程中脱落。

2. 在6孔细胞培养板中加入2ml培养基，放入培养箱中平衡约30-45分钟。

3. 加入盖玻片并再次平衡约25分钟。

4. 用激动剂处理细胞，通常处理时间为5-25分钟。

5. 快速吸去培养基，加入固定液（约2ml/孔），固定15-20分钟。

6. 清洗3次。

7. 吸去最后一次清洗液，干燥盖玻片边缘，加入Blotto封闭液（约50μl）并孵育20分钟。

8. 吸去Blotto，加入一抗，孵育45分钟。一抗需用Blotto稀释，常见稀释度包括：单克隆M1鼠抗Flag抗体（Sigma，Covance）（钙敏感）1:350-1:500；多克隆12CA5鼠抗HA（Roche）1:1000。

9. 清洗3次。

10. 再次用Blotto封闭5分钟。

11. 吸去Blotto，加入二抗，避光孵育20分钟。二抗同样需用Blotto稀释，例如：Cy3驴抗鼠（Jackson Immunoresearch）1:500，FITC山羊抗鼠1:500，TexasRed山羊抗鼠1:500。

12. 清洗3次。

13. 使用抗褪色封片液（如VectaShield或Citifluor）湿封，将盖玻片细胞面朝下置于载玻片上，吸去多余封片液，用指甲油封边。

试剂配方

清洗液：总计2升，含1mM CaCl₂的Maniatus TBS（16g NaCl，6g Tris碱，0.4g KCl，0.294g CaCl₂·2H₂O，pH 7.4）。

Blotto：总计10ml，含0.3g脱脂奶粉（3%），100μl 10% Triton X-100（0.1%），100μl 100mM CaCl₂（1mM），500μl 1M Tris-Cl pH 7.5（50mM）。

固定液：每片盖玻片约需2ml，37%甲醛用PBS（150mM NaCl，10mM NaPi，pH 7.4）1:10稀释。