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酵母细胞免疫荧光染色（IF）是一种重要的实验技术，用于研究蛋白质在细胞内的定位和分布。本文介绍了一种无需脱水处理的酵母IF实验方法。

实验步骤

1. 将酵母细胞在适当的温度下培养至5×10^6个细胞/ml（5ml YPD培养基）。

2. 添加0.5ml 37%甲醛（高品质），在相同温度下滚动培养10分钟。

3. 离心收集细胞（2000×g，3分钟），重悬于5ml 40mM KPO4（pH 6.5）/500μM MgCl2 + 0.5ml甲醛中，30°C（或之前培养温度）孵育1小时。

4. 用上述缓冲液（不含甲醛）洗涤细胞两次，再用含1.2M山梨醇的缓冲液洗涤一次。重悬于0.5ml山梨醇缓冲液中，4°C可保存过夜。

5. 使用Zymolyase（30μl，10mg/ml）处理细胞，30°C孵育10-30分钟或更长时间。用相差显微镜观察细胞状态。

6. 用山梨醇缓冲液洗涤细胞一次，重悬于100-500μl相同缓冲液中，置于冰上。

7. 用0.1%聚赖氨酸（>400,000 MW）涂层Teflon涂层玻片的孔洞，室温孵育10分钟。

8. 洗涤孔洞4-5次，用干净的离心水洗涤并干燥。

9. 将20μl细胞悬液点样于孔洞中，室温孵育10分钟。

10. 用PBS（pH 7.4）/0.5% BSA/0.5%卵白蛋白/0.5% Tween 20封闭细胞，室温孵育15分钟或过夜。

11. 加入一抗，适当稀释（实验确定），室温孵育1小时或更长时间。

12. 用封闭液洗涤细胞4次，每次5分钟。

13. 加入二抗（FITC标记），适当稀释，室温孵育1小时。

14. 洗涤细胞，滴加封片液，盖上盖玻片，用指甲油封片。

试剂配方

Zymolyase：使用高品质的Zymolyase 100T，在含山梨醇的磷酸盐缓冲液中溶解，离心10分钟后分装，液氮速冻，-80°C保存。

聚赖氨酸：购买高品质的聚赖氨酸（>400,000 MW），配制成1%水溶液，分装后液氮速冻，-80°C保存。

DAPI：配制成1mg/ml水溶液，-20°C保存。

封片液：100mg对苯二胺溶解于10ml PBS，调pH至8.0以上，加甘油至100ml，加入DAPI至50ng/ml，混匀后-20°C保存。