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简介

Sequenase[TM]是一种广泛应用于DNA测序的酶，特别适用于双链DNA反应。本文将详细介绍其操作流程、所需试剂以及注意事项，旨在为实验室提供标准化的操作指南，确保测序结果的准确性和重复性。

操作步骤

1. 在1.5毫升微量离心管中加入以下试剂：

• 5微升双链DNA（含5微克）
• 4微升1N氢氧化钠
• 3微升去离子水

2. 将反应体系在65-70°C温育5分钟，之后短暂离心以收集冷凝水。此步骤有助于DNA的变性和准备反应体系。

3. 向每个反应体系中加入：

• 3微升8微摩尔的引物
• 9微升去离子水
• 4微升MOPS酸性缓冲液

充分震荡混匀后，短暂离心以确保试剂均匀分布。

4. 向反应体系中加入：

• 4微升10X锰离子/异柠檬酸缓冲液
• 6微升ABI终止剂混合物
• 2微升稀释的Sequenase[TM]酶（工作浓度为3.25 U/微升）
• 1微升2 mM的α-S-脱氧核糖核苷三磷酸

在37°C下孵育10分钟。若进行多反应同时操作，应提前配制好反应混合液以确保一致性。

5. 反应终止：加入60微升8M氨基乙酸和300微升95%乙醇，充分混匀以停止反应。随后在冰水浴中沉淀DNA10分钟，离心15分钟（12000 rpm，4°C），小心倒出上清液，用80%乙醇洗涤沉淀，再次离心15分钟，倒出乙醇，确保DNA完全沉淀干燥。

6. 将DNA在Speedy-Vac中干燥5-10分钟，直至干燥状态，以便后续分析。

注意事项

- Sequenase[TM]酶应按照说明书进行稀释，确保酶活性稳定。美国生化公司提供的酶浓度为13 U/微升，需稀释1:4以获得工作浓度3.25 U/微升。

- 所有试剂应新鲜配制，避免污染，确保测序的准确性。

- 实验过程中应严格控制温度和时间，避免反应偏差影响结果。

通过标准化操作流程，Sequenase[TM]在DNA测序中的应用可以达到较高的准确率和重复性，为基因研究提供可靠的数据支持。更多详细信息可参考相关分子生物学教材或权威实验操作指南。