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描述

感受态细菌细胞的制备是分子生物学中的一项基础技术。以大肠杆菌为例，从甘油冻存管中解冻相应菌株，接种至50毫升液体培养基中，先在37°C水浴中预培养1小时（不振荡），然后转移至摇床中，在37°C、250 rpm条件下继续培养2-3小时。通过离心收集细胞，重悬于氯化钙溶液中，并在冰水浴中孵育。再次离心后，将细胞沉淀重悬于氯化钙溶液中，得到最终的感受态细胞悬液。感受态细胞可在4°C下保存数天。

主要作者
Bruce A. Roe ( broe@ou.edu )

所属机构
俄克拉荷马大学，美国

合著者
Judy S. Crabtree
Akbar S. Khan

步骤

1. 解冻大肠杆菌相应菌株的甘油冻存管，将其加入含有50毫升预热2xTY培养基的锥形瓶中，在37°C水浴中预培养1小时（不振荡）。然后在37°C、250 rpm条件下继续培养2-3小时。

2. 将40毫升菌液转移至无菌的50毫升聚丙烯离心管中，在4°C下以3000 rpm离心8分钟（使用GPR离心机）或6000 rpm离心8分钟（使用配备SS-34转子的RC5-B离心机）。对于基于M13的转化，将剩余的10毫升培养物保存在冰水浴中备用。

3. 离心后，弃去上清液，将细胞沉淀重悬于一半体积（20毫升）冷的无菌50 mM氯化钙溶液中，在冰水浴中孵育20分钟，然后如前所述离心。

4. 弃去上清液，将细胞沉淀轻轻重悬于十分之一体积（4毫升）冷的无菌50 mM氯化钙溶液中，得到最终的感受态细胞悬液。

用于冷冻保存的感受态细胞制备

1. 将2毫升GM272过夜培养物接种至50毫升2xTY培养基中，在37°C摇床中培养2至2.5小时。

2. 将细胞在冰上冷却10-15分钟，转移至50毫升聚丙烯离心管中，在4°C下以6000 rpm离心5分钟。

3. 将细胞沉淀重悬于20毫升冷冻保存缓冲液（FSB）中，轻轻涡旋，在冰上孵育10-15分钟。

4. 如前所述离心，将细胞沉淀重悬于4毫升FSB中，置于冰上。

5. 加入140微升新鲜DMSO，在冰上孵育15分钟。再加入140微升DMSO，在冰上继续孵育5分钟。

6. 将细胞转移至无菌Falcon培养管中（每管210微升）。此时，感受态细胞可置于-70°C下无限期保存。

7. 使用感受态细胞进行转化时，从冰箱中取出，在37°C下解冻几分钟。置于冰上，加入质粒DNA，按照标准转化程序孵育一小时。然后在42°C下热激2分钟，短暂冷却，加入1毫升2xTY培养基，在37°C下孵育1小时，然后涂板。

配方

（原文未提供具体配方）

耗材

（原文未提供具体耗材）

提示

（原文未提供具体提示）