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描述

本方案适用于大肠杆菌中质粒DNA的大量提取（Maxi-prep），通过碱裂解法结合酚氯仿抽提和乙醇沉淀，可获得高纯度质粒DNA，用于转染、测序等下游实验。以下为详细步骤。

实验步骤

1. 将单个菌落接种于5 mL含50 μg/mL氨苄青霉素（Sigma A-0166）的LB培养基中，37°C剧烈振荡（约250 rpm）培养过夜。

2. 取2.5 mL过夜培养物接种于250 mL含50 μg/mL氨苄青霉素的LB培养基中，37°C剧烈振荡（约250 rpm）培养过夜。

3. 次日早晨，将培养物于4°C、5000 × g离心15分钟收集菌体。

4. 弃上清，用6 mL冰预冷的裂解缓冲液重悬菌体（轻柔吹打），冰浴10分钟。

5. 加入7.5 mL新鲜配制的氯化钠（BDH 30123）/SDS溶液（Sigma L-4390），仅通过颠倒混匀，冰浴10分钟。

6. 加入7.5 mL冰预冷的3 M乙酸钠（pH 4.6，Qualigens 13905），颠倒混匀约10秒，冰浴20分钟。

7. 于4°C、12000 × g离心5分钟。

8. 将含质粒的上清转移至新离心管，避免吸到白色沉淀，加入DNase-free RNase A（Sigma R-9009）至终浓度20 μg/mL。

9. 混匀后于37°C孵育20分钟。

10. 加入0.5倍体积的Tris平衡酚（pH 8.0，SRL 1624132）和0.5倍体积的氯仿（Qualigens 12305）-异戊醇（Qualigens 21515）混合液，涡旋1分钟，12000 × g离心10分钟。

11. 重复步骤10一次。

12. 将上层水相转移至新离心管，加入1倍体积的氯仿-异戊醇混合液，涡旋1分钟，12000 × g离心10分钟。

13. 将上层水相转移至新离心管，加入2.5倍体积的乙醇（Merck 1.009883.0511），颠倒混匀，于-20°C沉淀过夜。

14. 于4°C、12000 × g离心30分钟回收DNA，用冰预冷的70%乙醇洗涤沉淀，空气干燥。

15. 将干燥的沉淀溶于500 μL水中，产量约为500-750 μg质粒DNA。

16. 使用Shimadzu UV 1601紫外可见分光光度计测定260 nm和280 nm吸光度，评估DNA浓度和纯度。

试剂配方

裂解缓冲液：50 mM葡萄糖，25 mM Tris-HCl（pH 8.0），10 mM EDTA（pH 8.0），使用前加入溶菌酶至终浓度1 mg/mL（可选）。

氯化钠/SDS溶液：0.2 M NaOH，1% SDS（现配现用）。

3 M乙酸钠（pH 4.6）：称取408.1 g三水乙酸钠溶于800 mL水，用冰乙酸调pH至4.6，定容至1 L。

耗材与试剂

LB培养基、氨苄青霉素、酚、氯仿、异戊醇、乙醇、RNase A等均为分子生物学级。

提示

1. 所有离心步骤均在4°C进行，以抑制核酸酶活性。

2. 酚氯仿抽提时避免吸入中间相和有机相。

3. 乙醇沉淀可缩短至2小时，但过夜沉淀产量更高。