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描述

两种主要的结合实验可用于确认目标受体（配体）与噬菌体展示配体的特异性结合：噬菌体捕获实验和基于ELISA的方法。噬菌体ELISA测量的是溶液相配体被固定在ELISA板塑料表面的噬菌体捕获的量。假设配体已被生物素化，以便通过链霉亲和素-碱性磷酸酶偶联物检测结合的配体。本方案中，ELISA程序需要使用“动力学”酶标仪，该仪器可在约3分钟间隔的20个时间点快速测量所有96个孔的OD值。ELISA还可通过抑制ELISA进行结合常数的半定量分析。抑制ELISA通过测量溶液中不同浓度的肽竞争性抑制受体与固定化配体结合的能力，来确定测试肽对受体的亲和力。

步骤

A. 生物素-BSA标准品

1. 解冻一瓶生物素化BSA溶液。

2. 用非生物素化BSA溶液稀释生物素化BSA溶液，制备10个稀释度，分别含0、4.5、9、13.5、18、22.5、27、31.5、36和40.5 ng/ml生物素化BSA。

3. 取50 μl这些标准品，包被每个ELISA板的一行10个孔。

4. 将ELISA板放置一旁备用。

B. 病毒颗粒制备

使用不同纯度的病毒颗粒作为固定化抗原。

C. 用病毒颗粒包被ELISA板孔

1. 本方案假设不使用ELISA板外侧的36个孔。如果使用全部96个孔，则需在F节第2步增加体积。

2. 用TBS将每种病毒颗粒制剂稀释至10^12个病毒颗粒/ml。

4. 每孔加入50 μl噬菌体稀释液。如有需要，可按照步骤1-2用生物素-BSA标准品包被部分孔。

5. 将板置于湿润塑料盒中，室温孵育至少2小时。

6. 在加入配体前，用TBS/Tween洗涤ELISA板5次，最好使用自动洗板机。

D. 直接ELISA和滴定ELISA

1. 在直接ELISA中，生物素化配体直接与噬菌体包被的孔反应。在滴定ELISA中，将梯度浓度的生物素化配体加入一系列具有相同固定化噬菌体的孔中，以确定ELISA信号如何随配体浓度变化。

2. 向包被并洗涤的ELISA板（C节第6步）中加入50-200 μl TTDBA（或其他含Tween-20的缓冲液）稀释的生物素化配体。

3. 将ELISA板置于湿润塑料盒中，在所需温度下孵育所需时间。

4. 按F节所述洗涤并显色ELISA板。

E. 抑制ELISA

1. 抑制ELISA通过测量溶液中不同浓度的肽竞争性抑制受体与固定化配体结合的能力，来确定测试肽对受体的亲和力。

2. 将受体的已知配体（通常为5×10^10个亲和筛选克隆的噬菌体，溶于50 μl TBS）吸附到96孔微孔板的一系列孔中（C节第3-6步）。同时，用50 μl生物素化BSA标准品（A节）包被同一微孔板的10个孔。

3. 向含有生物素化BSA标准品的孔中加入190 μl TTDBA。向配体包被的孔中加入190 μl含有预定固定浓度生物素化受体和梯度浓度抑制剂肽（游离形式或噬菌体形式）的TTDBA。

4. 将板置于湿润塑料盒中，4°C孵育过夜。

5. 按F节所述洗涤并显色ELISA板。

F. 显色ELISA

1. 向15 ml管中移取5 ml AP-SA稀释液。

2. 加入10 μl 0.5 mg/ml AP-SA（如果使用全部96孔，体积乘以1.5）。

3. 轻轻但彻底涡旋混匀。

4. 倒入多道移液器的分液槽中。将吸头装到多道移液器上，设置分液量为65 μl。

5. 用TBS/Tween洗涤ELISA板（预先制备）10次。

6. 向包被的孔中移取65 μl稀释的AP-SA（F节第4步）。

7. 室温反应30分钟。

8. 向分液槽中加入10 ml二乙醇胺缓冲液。

9. 向分液槽中的二乙醇胺缓冲液中加入10 μl MgCl2。

10. 向分液槽中加入100 μl NPP底物。

11. 反复倾斜分液槽彻底混匀。此为稀释的底物溶液。同时准备一个设置为90 μl的多道移液器。

12. 30分钟孵育结束后，用TBS/Tween洗涤ELISA板10-15次。

13. 使用步骤11中制备的多道移液器和分液槽，向孔中移取90 μl稀释的底物溶液。

14. 在动力学酶标仪上读取板，设置为每3分钟读取一次，共20次。记录405 nm和490 nm波长的光密度（OD），报告差值作为净OD读数。20次读取后，仪器计算并报告每个孔的斜率（mOD/min）。此为ELISA信号。

G. 计算

1. 将斜率转换为捕获的生物素的等效相对量

生物素化BSA标准品的斜率对输入浓度的依赖性用三次方程建模，该方程用于将其他孔的斜率转换为捕获的生物素化蛋白的等效相对量，记为Y。

2. 计算抑制ELISA中的抑制百分比

将无抑制剂孔的Y值平均，得到最大值Ymax。其他孔的抑制百分比计算为100×(Ymax - Y)/Ymax。

3. 抑制ELISA中的理论曲线

理论抑制曲线可假设未结合配体同时与溶液相抑制剂结合的配体和固定化配体结合的配体处于平衡状态来计算。曲线不仅受目标参数（抑制剂对受体的KD）影响，还受两个通常未知的关于固定化配体的干扰参数影响：其有效浓度（实际可用于与配体反应的量除以反应体积）及其对配体的KD。

配方

NPP底物：50 mg/ml对硝基苯磷酸盐，分装成100 μl等份，-20°C保存，用ddH2O配制。

TTDBA：用TBS/Tween配制，含1 mg/ml BSA，0.02% NaN3。

AP-SA：冰箱保存。称量小瓶，加入1.26 g（1 ml）上述冰冷混合物。盖紧盖子，剧烈涡旋并反复颠倒混匀。置于冰上。短暂离心，打开隔膜，将溶液平均分到两个1.5 ml微量离心管中。0.5 mg/ml碱性磷酸酶偶联链霉亲和素储备液。短暂离心商品化链霉亲和素管。关闭橡胶隔膜，用封口膜包裹管顶。在1.5 ml微量离心管中，量取30 μl 1 M MgCl2和2 μl ZnCl2。然后称取1.89 g超纯甘油。将管固定在旋转器上，在冷室中旋转约30分钟以彻底混匀。打开管，保持橡胶隔膜清洁。

1 M MgCl2。

二乙醇胺pH 9.8：用HCl调pH，无需高压灭菌。1 M二乙醇胺储备液用于ELISA。

TBS/Tween：用TBS配制，含0.5%（v/v）Tween-20。

透析BSA：-20°C保存，过滤除菌，用ddH2O配制。50 mg/ml无生物素牛血清白蛋白（BSA）（Sigma）。

TBS/明胶：室温保存。将0.1 g明胶溶于100 ml TBS中高压灭菌。高压灭菌后，旋动混匀融化的明胶。

AP-SA稀释液：1 mg/ml透析BSA，0.1% Tween 20，50 mM Tris-HCl pH 7.5，150 mM NaCl。

TBS（1×）：50 mM Tris HCl，pH 7.5，150 mM NaCl，室温保存，可高压灭菌。

非生物素化BSA溶液：100 μg/ml BSA（非生物素化），用TBS配制。

生物素化BSA溶液：2 mg/ml生物素化BSA（Sigma A6043），用ddH2O配制，过滤除菌，4°C保存。

耗材

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提示

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