生物行移动版

本方案详细描述了电穿孔感受态细菌的制备及其与重组噬菌体DNA的转染过程。高质量噬菌体展示文库的构建依赖于高效基因转移至感受态细胞。以下为具体步骤。

A. 冷冻电感受态细胞的制备

1. 在两个3升Fernbach培养瓶中各加入500 ml LB培养基，松盖后高压灭菌。

2. 用MC1061细菌单菌落接种4.5 ml NZY培养基（含100 μg/ml链霉素），垂直放置试管，37°C、300 rpm振荡过夜培养。

3. 将所有溶液、试管和设备在4°C预冷过夜。同时预冷一个用于存放电感受态细菌的-80°C盒子。

4. 次日，向步骤1中的每个培养瓶加入2 ml过夜培养物。37°C、300 rpm振荡培养至OD600在0.4-0.5之间。

5. 培养期间，准备干冰粉末。

6. 将培养瓶在冰水浴中冷却15分钟，期间频繁摇动。同时将预冷的离心瓶、试管和0.5 ml微量离心管置于冰上。

7. 将每瓶培养物均匀分入三个预冷的250 ml离心瓶中，使用Sorvall™ GSA转子在4°C、2000 rpm（650×g）离心15分钟。

8. 小心倒出上清，避免损失细胞。

9. 用150 ml冰冷的1 mM HEPES（pH 7.0）轻轻重悬每个离心瓶中的细胞沉淀。

10. 重复步骤7和8。

11. 用60 ml冰冷的1 mM HEPES（pH 7.0）轻轻重悬每个离心瓶中的细胞沉淀。将重悬细胞合并至两个瓶中（每瓶180 ml）。

12. 重复步骤7和8。

13. 用10 ml冰冷的10%（v/v）甘油重悬每个瓶中的细胞沉淀。将两个瓶的重悬细胞合并至一个预冷的无菌Oak Ridge管中。

14. 使用Sorvall™ SS-34转子在4°C、3000 rpm（1000×g）离心10分钟。

15. 小心倒出上清。

16. 用500 μl冰冷的10%（v/v）甘油轻轻重悬细胞沉淀。总体积应在1.2-2 ml之间。将细胞悬液转移至预冷的2 ml微量离心管中。

17. 在冷藏室内，将200 μl等分细胞分装至预冷的500 μl微量离心管中，并盖紧盖子。

18. 将每个试管浸入干冰粉末中，使大部分试管浸没。

19. 5分钟后，将试管转移至-80°C预冷的容器中。细胞可长期保存于-80°C。

B. 电穿孔

1. 预冷0.2 cm电穿孔比色杯和电穿孔仪的比色杯架。

2. 准备干冰粉末，将所需数量的冷冻电感受态细胞试管置于干冰上。

3. 设置电穿孔仪参数：2.5 kV、25 μF、400 Ω。

4. 准备一排无菌15 ml锥形管（每管用于一次电穿孔），每管加入2 ml SOC培养基。对于fd-tet衍生载体，SOC中补充0.2 μg/ml四环素。同时准备无菌玻璃巴斯德吸管和吸头。

5. 在巴斯德吸管上安装滴管球，打开一管SOC，将吸管插入其中。将打开的管盖朝上放在实验台上。

6. 通过拇指和食指来回搓动试管解冻一管电感受态细胞。解冻开始时，打开细胞管，加入DNA溶液，用吸头轻轻搅拌直至完全解冻。将试管置于冰上1-2分钟。

7. 小心地将细胞/DNA混合物吸至冰冷的比色杯底部，避免产生气泡。轻弹比色杯使悬液下沉，放回冰上约10秒。

8. 将比色杯插入电穿孔仪的比色杯架中，施加电脉冲。

9. 电击成功后，立即从15 ml管中吸取2 ml SOC（如适用含0.2 μg/ml四环素）加入比色杯，轻轻吹打数次重悬细胞。将细胞悬液转移回15 ml管中，松盖。

10. 37°C、225 rpm振荡培养1小时。

11. 为滴定转染子或获得单个转染子克隆，将适当系列稀释的培养物取200 μl涂布于含40 μg/ml四环素（用于fd-tet载体）和100 μg/ml链霉素（用于MC1061）的NZY平板上。

12. 对于文库构建，将最多三个2 ml培养物合并至一个3升Fernbach瓶中，内含1升NZY培养基（补充20 μg/ml四环素）。

13. 混合细胞与培养基后，取少量样品制备适当系列稀释液，取200 μl涂布于含40 μg/ml四环素和100 μg/ml链霉素的NZY平板上。预期产量为每μg DNA获得1-3×10^7个克隆。

配方

SOC：室温保存。向100 ml SOB中加入1 ml 2 M葡萄糖。

镁溶液：过滤灭菌，室温保存。1 M MgCl2，1 M MgSO4。

0.2 M IPTG：过滤灭菌，4°C保存。

SOB：冷却后加入1 ml镁溶液，室温保存。0.58 g NaCl，0.19 g KCl，5 g酵母提取物，20 g胰蛋白胨，溶于1 L ddH2O，高压灭菌100 ml分装于125 ml瓶中。

四环素（1000×）：过滤灭菌，铝箔包裹避光，-20°C保存。40 ml 40 mg/ml四环素，加入40 ml灭菌100%甘油。

1 mM HEPES pH 7.0（2 L）：9体积无菌ddH2O，1体积0.1 M HEPES pH 7.0，4°C保存。

2 M葡萄糖：过滤灭菌。

0.1 M HEPES pH 7.0：高压灭菌，室温保存。用NaOH调pH至7.0（注意：生物危害）。

10%（v/v）甘油：高压灭菌，4°C保存。

链霉素（50 mg/ml储存液）：0.6 g硫酸链霉素溶于10.5 ml ddH2O，过滤灭菌，4°C保存。

NZY培养基：5 g NaCl，10 g NZ Amine A，5 g酵母提取物，溶于1 L ddH2O，用NaOH调pH至7.5，高压灭菌。固体培养基加20 g琼脂。

LB：5 g NaCl，10 g胰蛋白胨，5 g酵母提取物，溶于1 L ddH2O，用NaOH调pH至7.0。

提示

1. 注意：某些物质具有生物危害，请查阅MSDS。

2. 本方案仅制备所需细胞量的一半，制备大型噬菌体展示文库需另备一批。

3. MC1061菌株为F-，基因型：araD139 Δ(ara-leu)7696 Δlac174 galU galK hsr- hsm+ strA，链霉素抗性。

4. 可用液氮替代干冰，但本方案贡献者未成功使用液氮。

5. 操作过程中保持细胞低温，使用冰桶持续冷却细胞悬液，最好在冷藏室操作，动作迅速轻柔。

6. 轻柔重悬可提高活细胞产量，在低渗甘油和HEPES溶液中细胞易裂解。

7. 可使用其他可灭菌、耐受离心力的试管。

8. 可自行构建廉价电穿孔设备替代市售产品。

9. 比色杯专为电穿孔设计，内含金属板导电。电穿孔设备供应商众多（如BioRad GenePulser）。

10. 大型文库制备时，建议向200 μl电感受态细胞中加入最多8 μg DNA（溶于最多15 μl TE或ddH2O）。常规小规模电穿孔，向50 μl细胞中加入0.1-1 ng DNA（≤5 μl缓冲液）。低浓度DNA时，加入100 μg/ml载体RNA防止吸附损失。

11. 请查阅设备制造商手册。

12. 低浓度四环素不足以影响敏感细胞，但可诱导fd-tet载体上四环素抗性基因表达，使成功电穿孔细胞能在高浓度四环素固体培养基上选择性生长。

13. 转化效率可达每μg输入DNA产生3×10^9个克隆（纯化的fd-tet衍生噬菌体RF）。

14. 若载体为f88-4，培养基中需加入1 mM IPTG诱导重组基因VIII表达（MC1061宿主细胞中非必需，因其无完整lacI基因）。

15. 1升培养物接种三个2 ml SOC培养物（每个代表200 μl电感受态细胞电转8 μg DNA），可产生2.4-7.2×10^8个克隆（2.4-7.2×10^5转染子/ml）。相当于从1升培养物的1/1000稀释液涂布200 μl得到48-144个菌落。大型噬菌体展示文库需制备四个1升培养物并分别滴定。