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描述

本方案详细描述了将质粒DNA导入农杆菌（Agrobacterium）的标准操作流程，适用于GV3101和LBA4404等常用菌株。农杆菌介导的转化是植物基因工程中的核心技术，通过冻融法将重组质粒导入农杆菌，进而用于植物遗传转化。

实验步骤

1. 在28°C条件下，于LB培养基中培养10 ml过夜培养物（对于GV3101菌株，添加25 mg/ml庆大霉素；对于LBA4404菌株，添加34 mg/ml利福平）。

2. 将过夜培养物按约1:100稀释到10 ml LB培养基（含相应抗生素）中，于28°C培养6-8小时。注意：LBA4404生长较慢，需延长培养时间。

3. 当培养物达到中度浑浊状态（仍处于对数生长期）时，每次转化取约2 ml培养物转移至2 ml离心管中，冰上冷却1-5分钟，然后在微量离心机中离心2-3分钟沉淀细胞。注意：此阶段测量OD值意义不大，因为农杆菌培养物易积累死细胞。

4. 吸弃上清液，加入1 ml冰冷的10 mM Tris（pH 7.5），轻轻但彻底重悬细胞，再次离心沉淀。

5. 用200 μl冰冷的LB重悬细胞，此时细胞应能良好重悬。注意：若细胞呈团块状重悬，建议重新开始，否则转化效率极低。

6. 向细胞中加入约1-2 μg质粒DNA，液氮冷冻5分钟。

7. 迅速将离心管转移至37°C水浴，孵育5分钟。

8. 加入1 ml新鲜LB，于28°C恢复培养2-3小时。

9. 取200-500 μl细胞涂布于选择性平板上，于28°C培养约2天（GV3101）至3天（LBA4404）。

配方

LB培养基：10 g/L胰蛋白胨，5 g/L酵母提取物，10 g/L NaCl，pH 7.0。固体培养基添加15 g/L琼脂。

10 mM Tris（pH 7.5）：1.21 g Tris碱溶于800 ml水，用HCl调pH至7.5，定容至1 L。

耗材

微量离心管、移液器吸头、培养皿、接种环等常规分子生物学耗材。

提示

1. 所有操作需在无菌条件下进行。

2. 液氮冷冻和37°C热激步骤是冻融法的关键，确保快速转移。

3. 农杆菌感受态细胞可提前制备并保存于-80°C，但新鲜制备的细胞转化效率更高。