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描述

S1核酸酶检测是一种用于分析RNA的分子生物学技术，通过使用标记的寡核苷酸探针与目标RNA杂交，然后利用S1核酸酶消化未杂交的单链区域，从而定量或定性检测特定RNA序列。本方案详细描述了实验步骤，包括杂交、S1核酸酶消化、沉淀和电泳分析。

实验步骤

1. 杂交RNA与标记的寡核苷酸探针（50微升体系）

在无RNA酶的0.2毫升微量离心管中混合以下成分：

• 15微克总酵母RNA
• 50,000-100,000 cpm标记的寡核苷酸探针
• 5微升10×杂交缓冲液
• 0.2微升25% Triton X-100
• 加水至终体积50微升

将管子放入带有加热盖的热循环仪中，防止样品蒸发。加热至94℃ 3分钟，然后降温至55℃孵育过夜（至少10小时）。注意：特定应用的最佳温度可能需要调整。

2. S1核酸酶消化

准备S1消化混合液（1个反应）：

• 0.33 M NaCl：148.5微升 1 M NaCl
• 66 mM NaOAc pH 4.6：29.7微升 1 M NaOAc
• 2.2 mM ZnSO4：9.9微升 0.1 M ZnSO4
• 0.01% Triton X-100：0.18微升 25% Triton X-100
• 20单位S1核酸酶（Invitrogen）：0.2微升 100 U/微升
• 加水至终体积450微升

如有必要，用制造商提供的S1稀释缓冲液稀释S1核酸酶。从热循环仪中取出杂交管，快速离心使液体沉底。将杂交反应液转移至1.5毫升Eppendorf管中，加入450微升S1消化混合液，混匀，快速离心，在37℃孵育30分钟。

3. 终止核酸酶消化并沉淀

30分钟孵育后，迅速终止反应并进行乙醇沉淀：

• 加入30微升终止混合液：
  • 2.5 M NaOAc：25微升 3 M NaOAc
  • 40 mM EDTA：5微升 0.25 M EDTA
  • 3微克tRNA：0.1微升 30 mg/ml tRNA
• 加入1毫升100%乙醇，混匀，在干冰上冷冻至少12分钟。
• 在微量离心机中离心10分钟，弃去上清。
• 用100%乙醇洗涤沉淀，在Speedvac中短暂干燥。
• 用8微升2倍稀释的Quickpoint样品缓冲液重悬，加热至90℃ 1分钟，置于冰上。
• 上样至8% Quickpoint凝胶，电泳直至溴酚蓝染料跑出凝胶底部（约13分钟，1200伏）。

10×杂交缓冲液配方

• 3 M NaCl
• 10 mM EDTA
• 380 mM HEPES pH 7.0

寡核苷酸探针设计

对于每个待分析的RNA，寡核苷酸应包含至少35个残基（可高达70个残基或更多），与RNA编码链互补。所有寡核苷酸应通过凝胶纯化以获得清晰信号。使用Quickpoint凝胶系统可分辨至少相差5 bp的片段。如果不关心5'端，探针可与mRNA的任何部分互补。建议探针的GC含量至少为50%，且5'端为GC（以防止呼吸作用导致S1人工切割）。此外，在探针3'端添加4-6个与mRNA反互补的碱基（即嘌呤-嘌呤或嘧啶-嘧啶），以区分未消化的探针与真正的mRNA/DNA杂交体。如果关心5'起始位点，探针设计基本相同，但3'端应与起始位点之外的RNA互补（以便区分未消化探针与真正杂交体）。杂交反应可同时包含至少2-3个探针，只要产物能够分辨。