描述 该文库来源于L. esculentum（番茄）品种VFNT Cherry和Rio Grande-PtoR。粘粒文库通过EcoRI部分消化总基因组DNA，克隆至pYAC4的BamHI位点构建，经CHEF凝胶电泳筛选大小约150-200 Kb的片段。文库平均插入片段大小为50-400 Kb。 操作流程 YAC DNA分离步骤 总DNA制备
本流程适用于中等大小DNA片段的分离，适合PCR和Southern杂交。 1. 从单个红色菌落中，在50 ml AHC（或其他最低培养基如SD）中于30°C培养酵母细胞约36-48小时，至OD260约2.5。
2. 4-5000 ×g离心5分钟。
3. 用无菌去离子水洗涤沉淀。
4. 4-5000 ×g离心5分钟。
5. 重悬于5 ml CBS + 25 μl YLE中，室温孵育1小时*。
- CBS可用SCE替代。YLE（储备液）可用2 mg溶壁酶替代。
- 此步骤前可剧烈吹打细胞。
*1小时孵育可能过长。每10分钟测量A800处OD值（1:20稀释于水中，1 ml比色皿：950 μl水+50 μl细胞悬液）。当OD降至原始值的20-30%时停止孵育。 6. 1000 rpm离心5分钟沉淀原生质球。
7. 重悬于5 ml TE+ + 500 μl 10% SDS中；65°C孵育30分钟。
8. 转移上清至新管，加入1.5 ml 5 M乙酸钾。冰上孵育1小时。
9. 4°C下12,000 ×g离心10分钟。
10. 转移上清至新管，加入等体积异丙醇（室温）。
11. 12,000 ×g离心10分钟。
12. 重悬湿沉淀于3 ml TE（1 M Tris, 1 M EDTA, pH 8.0）。
13. 12,000 ×g离心10分钟。
14. 转移上清至新管，加入150 μl RNA酶A（1 mg/ml），37°C孵育。
15. 加入0.1体积3 M乙酸钠 + 0.5体积异丙醇。
16. 12,000 ×g离心30秒。
17. 重悬于400 μl TE。 试剂配制
YLE: 20,000 U酵母裂解酶（ICN #152270或Sigma L-5263）/ ml CSB II
CSB I: 1 M山梨醇, 0.1 M柠檬酸钠 pH 5.8, 10 mM EDTA, 30 mM β-巯基乙醇（非必需）
CSB II: 10 mM Tris-HCl pH 7.2, 20 mM NaCl, 50 mM EDTA
TE+: 50 mM Tris-HCl pH 7.4, 20 mM EDTA 超级池DNA制备
适用于通过PCR筛选超级池DNA的快速流程。 1. 对于每个YAC微孔板，准备一个14-15 cm的YPD琼脂平板。
2. 使用平板复制器将每个YAC微孔板印迹到平板上，30°C培养48小时。
3. 将96个菌落刮入10 ml含20%甘油的TE中。取1 ml至2.0 ml管用于DNA制备。其余-80°C保存备用。
4. 加入250 μl玻璃珠（0.45-0.50 mm，2.0 ml管中高压灭菌）。
5. 加入400 μl提取缓冲液。 1×提取缓冲液（200 ml）
200 mM Tris-HCl pH 7.5: 80 ml 0.5 M Tris-HCl pH 7.5
250 mM NaCl: 10 ml 5.0 M NaCl
25 mM EDTA: 25 ml 200 mM EDTA pH 7.0
0.5% SDS: 5 ml 20% SDS（高压灭菌后加入）
加水至195 ml，高压灭菌后加入SDS。 6. 涡旋细胞、玻璃珠和缓冲液5分钟。
7. 转移上清至新管。
8. 加入冷异丙醇，室温混匀2分钟。
9. 13,000 rpm离心5分钟，弃上清。
10. 重悬沉淀于400 μl水中，涡旋。
11. 50 μl PCR反应使用1 μl。 酵母染色体及大规模YAC分离（Carle and Olson, 1985）
1. 从单个菌落中，在50-100 ml YPD中培养酵母细胞。分装至50 ml管。
2. 4°C离心（5分钟，5000 rpm，2000 rpm或更低也可）。重悬沉淀于50 ml 50 mM EDTA pH 7.5，重复离心。 酵母储存培养基（甘油保存）
1% Bacto酵母提取物, 2% Bacto蛋白胨, 2%葡萄糖, 20%甘油。 (责任编辑：泉水) |